吳林坤　陳　軍　吳紅淼　王娟英　秦賢金　張重義林文雄,*

1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建福州 350002;2福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002

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地黃連作脅迫響應(yīng)機(jī)制的塊根蛋白質(zhì)組學(xué)分析

吳林坤1,2陳軍1,2吳紅淼1,2王娟英1,2秦賢金1,2張重義2林文雄1,2,*

1福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建福州 350002;2福建省農(nóng)業(yè)生態(tài)過程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002

摘要:地黃種植過程中存在嚴(yán)重的連作障礙問題, 連作導(dǎo)致塊根無法正常膨大、產(chǎn)量品質(zhì)下降、土傳病害嚴(yán)重等。本研究以正、重茬地黃塊根為試驗(yàn)材料, 通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析連作下地黃塊根蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化, 并進(jìn)一步采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)鎖定的差異蛋白質(zhì)表達(dá)量變化進(jìn)行驗(yàn)證分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 連作導(dǎo)致與塊根重要生理代謝過程和主要成分合成相關(guān)的蛋白質(zhì)都下調(diào)表達(dá), 與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的伴侶素(chaperonin)在重茬地黃塊根中全部下調(diào)表達(dá); 連作下與脅迫響應(yīng)、抵御相關(guān)的蛋白質(zhì)(如pathogenesis-related protein 10, cytochrome P450, Type IIIa membrane protein cp-wap13等)均上調(diào)表達(dá)。qRT-PCR定量分析證實(shí)重茬地黃塊根中PR-10基因表達(dá)量顯著高于正茬地黃; PR-10基因在尖孢鐮刀菌病原菌侵染下能夠明顯被誘導(dǎo)表達(dá), 表達(dá)量隨著侵染時(shí)間的增加而逐漸升高, 驗(yàn)證了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果。可見連作脅迫對(duì)地黃塊根蛋白質(zhì)表達(dá)譜有顯著影響, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)紊亂, 連作植株生理代謝過程異常, 碳水化合物和能量代謝緩慢, 產(chǎn)生連作障礙效應(yīng)。

關(guān)鍵詞:地黃; 連作障礙; 差異蛋白質(zhì)組學(xué); 病程相關(guān)蛋白; 脅迫響應(yīng)

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81303170), 國(guó)家自然基金聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1205021)和福建農(nóng)林大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文基金項(xiàng)目(324-1122yb005)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (81303170, U1205021) and the Scientific Research Foundation of Graduate School of Fujian Agriculture and Forestry University (324-1122yb005).

第一作者聯(lián)系方式: E-mail: wulinkun6a19@163.com

連作障礙(consecutive monoculture problem), 也稱為自毒作用、重茬問題或土壤病, 是指即使正常的田間管理措施下, 連續(xù)多年種植相同或相似植物于同一地塊會(huì)造成生長(zhǎng)發(fā)育不良、病蟲害嚴(yán)重、產(chǎn)量品質(zhì)下降的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象。目前, 隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展, 規(guī)模化、集約化、單一化連續(xù)種植模式十分普遍, 其造成的損失也是十分巨大的, 而且這一趨勢(shì)正逐年嚴(yán)重。長(zhǎng)期困擾我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的連作障礙問題, 在地黃、人參等中藥材栽培生產(chǎn)中表現(xiàn)尤為嚴(yán)重, 約70％的塊根類藥用植物都存在不同程度的連作障礙問題[1]。地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)為玄參科地黃屬多年生草本藥用植物, 其藥用歷史悠久, 有重要藥用價(jià)值。但地黃連作導(dǎo)致藥用部位——塊根無法正常膨大, 產(chǎn)量、品質(zhì)嚴(yán)重下降, 甚至造成絕收。通常每茬收獲后同一地塊需間隔8～10年后方可再種, 這嚴(yán)重制約了我國(guó)中藥資源的可持續(xù)發(fā)展與利用。更為嚴(yán)重的是, 在連作障礙機(jī)制尚不清楚的情況下, 農(nóng)戶往往通過濫施化肥、濫用農(nóng)藥來試圖維持產(chǎn)量, 但是效果不佳, 而且?guī)砹酥兴幉霓r(nóng)殘超標(biāo)、污染環(huán)境等一系列問題。因此, 探究藥用植物連作障礙發(fā)生的機(jī)理和尋求克服或緩解措施已成為亟待解決的問題。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)植物連作障礙機(jī)制的研究主要聚焦于土壤養(yǎng)分匱乏或失調(diào); 根系分泌物的化感自毒作用; 根際微生物群落結(jié)構(gòu)失衡3個(gè)方面。但是越來越多的研究結(jié)果認(rèn)為, 土壤肥力不是主要因素, 而且許多研究結(jié)果表明連作土壤主要營(yíng)養(yǎng)元素的含量并不隨著種植年限的增加而下降, 這也在我們對(duì)地黃連作的研究中得到了證實(shí)[2]。至于根系分泌物的化感自毒效應(yīng)方面, 先前的研究都主要采用生測(cè)法來直接評(píng)價(jià)對(duì)靶標(biāo)受體植物生長(zhǎng)的影響, 此方法不僅忽略了土壤物理化學(xué)因素對(duì)根系分泌物活性的影響如土壤吸附遷移等過程, 還忽視了土壤微生物的加工、轉(zhuǎn)化及降解等過程[3]。近年來, 越來越多的研究認(rèn)為連作障礙是由根系分泌物介導(dǎo)下的根際微生態(tài)結(jié)構(gòu)惡化造成[4], 地黃連作同樣也造成根際微生物群落結(jié)構(gòu)失衡, 導(dǎo)致病原菌大量生長(zhǎng), 引發(fā)障礙效應(yīng)[2,5]。

根際微生態(tài)環(huán)境惡化勢(shì)必影響地黃塊根的正常生理代謝及脅迫響應(yīng)過程, 研究地黃塊根連作下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化反之可為揭示地黃連作障礙的形成機(jī)理提供根據(jù)。前人研究表明, 單一化栽培模式下, 地黃植株能夠通過miRNAs調(diào)控因子來調(diào)控靶基因的表達(dá)模式, 以應(yīng)對(duì)源自土壤中的環(huán)境脅迫因子[6]。但是, 蛋白質(zhì)才是細(xì)胞活性和功能的最終執(zhí)行者, mRNA與蛋白質(zhì)之間并不是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,初始mRNA轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過加工與修飾后才能形成成熟的mRNA。迄今, 有關(guān)地黃響應(yīng)連作脅迫的塊根蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化的研究未見報(bào)道。因此, 本研究基于前期優(yōu)化確定的最佳地黃塊根總蛋白提取與分離方法, 對(duì)正、重茬地黃塊根蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異進(jìn)行分析, 以鎖定關(guān)鍵蛋白質(zhì), 并通過qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證分析在分離篩選的特異病原微生物作用下關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化趨勢(shì), 以進(jìn)一步研究土壤環(huán)境災(zāi)變(如土傳病原菌)對(duì)地黃植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響以及地黃響應(yīng)連作逆境脅迫的生物學(xué)過程。研究結(jié)果可為揭示地黃連作障礙的形成機(jī)制及探究植物–微生物根際互作等提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1田間試驗(yàn)及取樣

以廣泛種植的溫85-5懷地黃為試驗(yàn)材料。在道地產(chǎn)區(qū)河南省焦作市溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(34o56′N, 112o58′E)進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)置正茬(頭茬種植, 對(duì)照組)與重茬(連作2年, 試驗(yàn)組) 2個(gè)處理。在同一地塊的不同小區(qū)中種植對(duì)照組與試驗(yàn)組, 以保證土壤質(zhì)地、微氣候條件等相同。地黃整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間, 水分、肥料等措施管理保持一致。地黃塊根膨大中期取塊根樣品, 洗凈剪碎后立即用液氮速凍, 放入–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2地黃塊根蛋白質(zhì)提取與電泳分離

基于前期優(yōu)化確定的最佳地黃塊根總蛋白提取與分離方法[7], 對(duì)正、重茬地黃塊根蛋白質(zhì)進(jìn)行提取與分離。設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù), 基于銀染圖譜進(jìn)行差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析(n=3), 基于考染圖譜進(jìn)行差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定。

1.3蛋白質(zhì)酶解及MALDI TOF-TOF MS鑒定

采用胰島素酶酶解差異蛋白點(diǎn), 采用MALDI

TOF-TOF MS進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定。參照李奇松等[8]的方法。比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí), 參數(shù)設(shè)置如下: 數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr全庫(kù), 胰酶消化, 最大允許漏切位點(diǎn)為1,母離子質(zhì)量偏差容忍度為100×10–6, MS/MS二級(jí)肽段質(zhì)量偏差為0.6 Da, 固定修飾為半胱氨酸酰胺甲基化, 可變修飾為甲硫氨酸氧化。

1.4蛋白質(zhì)GO分析

成功鑒定的蛋白質(zhì)根據(jù)KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome. jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能歸類, 進(jìn)一步借助Uniprot (http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Gene Ontology (GO)注釋分析, 并用WEGO (http://wego.genomics. org.cn/cgi-bin/wego/index.pl)工具制圖[9]。

1.5qRT-PCR驗(yàn)證分析關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)量變化

取正重茬地黃塊根各100 mg用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒(TIANGEN, 北京)按照說明書提取總RNA, 用Nanodrop 2000C Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA)測(cè)定濃度。取等量總RNA 用TIANScript RT Kit試劑盒(TIANGEN, 北京)分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA第1鏈。

經(jīng)差異蛋白質(zhì)組學(xué)及蛋白功能分析, 鎖定2個(gè)連作脅迫下發(fā)生顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì), 即病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein 10, PR-10蛋白,序列已登入NCBI)和S-adenosylmethionine (SAM)合成酶, 進(jìn)一步運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)進(jìn)行表達(dá)量變化驗(yàn)證。PR-10蛋白特異引物序列為PR-F (5'-GCCGGAATTCATGGGTATCACCAAAC ACATCC-3')和PR-R (5'-TTACTCGAGGGCGCAGA CATTAGGATTGGCAT-3')。以Actin作為內(nèi)參基因,引物序列為AT-F (5'-CAACCCCAAGGCAAACAGA -3')和AT-R (5'-GGCAAGATCCAAACGCAAG-3')。熒光定量PCR體系含2×SuperRealPreMix Plus (含SYBR Green I) 7.5 μL、引物各0.6 μL、cDNA模板0.45 μL、RNase-Free ddH2O 5.85 μL。熒光定量PCR擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性10 min, 95℃變性10 s, 64℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán), 在每個(gè)循環(huán)的延伸階段檢測(cè)熒光信號(hào)。SAM合成酶基因qRT-PCR分析的特異引物及擴(kuò)增程序參考范華敏等[10]。采用2–ΔΔCt法計(jì)算正重茬PR-10與SAM合成酶基因表達(dá)量差異。

1.6尖孢鐮刀菌對(duì)地黃生長(zhǎng)及PR-10基因表達(dá)量的影響

課題組前期從地黃連作土壤和發(fā)病植株中高頻篩選到多株尖孢鐮刀菌病原真菌[5], 本研究將分離到的一株?；图怄哏牭毒罨囵B(yǎng)后, 接種至地黃組培瓶中(離苗根部1.5 cm處接種), 動(dòng)態(tài)觀察尖孢鐮刀菌對(duì)地黃組培苗的侵害。同時(shí), 動(dòng)態(tài)取地黃組培苗樣品以驗(yàn)證分析尖孢鐮刀菌侵染下地黃PR-10基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)?？俁NA提取、逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR步驟同1.5。

2　結(jié)果與分析

2.1正重茬地黃塊根差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析

基于優(yōu)化建立的雙向電泳體系, 分別構(gòu)建了正、重茬地黃塊根蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜(圖1)。Scatters Plot分析發(fā)現(xiàn)正重茬地黃塊根蛋白圖譜的平均相關(guān)系數(shù)達(dá)0.812, 可見正重茬地黃塊根具有相似的蛋白質(zhì)點(diǎn)分布信息, 二者的主要差異在于蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化。

采用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法, 分析正重茬塊根蛋白質(zhì)表達(dá)豐度, 共發(fā)現(xiàn)37個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對(duì)豐度顯著變化(表1和圖2)。與正茬相比, 重茬塊根中有6個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá), 31個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá)。經(jīng)MALDI TOF-TOF MS質(zhì)譜分析, 共成功鑒定出34個(gè)蛋白質(zhì)(表1)。

2.2差異蛋白質(zhì)GO分析和KEGG分析

Gene Ontology (GO)分析發(fā)現(xiàn), 所有成功鑒定的蛋白質(zhì)按細(xì)胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物過程(biological process)可分別分為7類、3類和11類。細(xì)胞組成中, 細(xì)胞和細(xì)胞組分所占的比例最高; 分子功能中, 結(jié)合和催化所占的比例最高; 生物過程中, 細(xì)胞過程和代謝過程所占的比例最高(圖3)。

進(jìn)一步, 運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)成功鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能歸類, 共分為10類(表1): (1)碳水化合物/能量代謝(5個(gè), 蛋白點(diǎn)2、5、13、28、31); (2)氨基酸代謝(8個(gè), 蛋白點(diǎn)3、17、18、19、21、24、32、34); (3)核酸代謝(1個(gè), 蛋白點(diǎn)29); (4)淀粉代謝(3個(gè),蛋白點(diǎn)11、12、25); (5)萜類代謝(1個(gè), 蛋白點(diǎn)4); (6)蛋白質(zhì)代謝(9個(gè), 蛋白點(diǎn)7、8、9、10、15、16、27、30、33); (7)異源物質(zhì)代謝(1個(gè), 蛋白點(diǎn)20); (8)脅迫響應(yīng)(3個(gè), 蛋白點(diǎn)14、22、26); (9)信號(hào)傳導(dǎo)(1個(gè), 蛋白點(diǎn)23); (10)未知功能(2個(gè), 蛋白點(diǎn)1、6)。其中, 蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的差異蛋白點(diǎn)所占比例最大, 為26.5％, 其次為氨基酸代謝相關(guān)(23.5％)和碳水化合物代謝相關(guān)(14.7％)蛋白質(zhì)(圖4)。

圖1　正茬(A)與重茬(B)地黃塊根蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig. 1　Silver stained 2-DE gels of proteins extracted from the tuber roots of the newly planting (A) and monocropping (B) R. glutinosa

圖2　正、重茬地黃塊根部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)局部放大圖Fig. 2　Close-up views of part of differentially expressed proteins extracted from the tuber roots of newly planting and monoculturing R. glutinosa

圖3　地黃塊根差異蛋白質(zhì)Gene Ontology分析Fig. 3　Gene Ontology (GO) for the differentially expressed proteins

圖4　差異蛋白質(zhì)功能歸類圖Fig. 4　Functional classification of the differentially expressed proteins

結(jié)合蛋白點(diǎn)相對(duì)表達(dá)豐度可以看出, 連作下,地黃塊根中與碳水化合物代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、淀粉代謝、萜類代謝、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)幾乎都下調(diào)表達(dá), 尤其發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的伴侶素(chaperonin)在重茬塊根中全部下調(diào)表達(dá)。然而, 重茬塊根中與異源物質(zhì)代謝相關(guān)、脅迫響應(yīng)相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)全部上調(diào)表達(dá), 尤其發(fā)現(xiàn)一個(gè)病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein, PR蛋白)顯著上調(diào)表達(dá)(表1)?？梢? 地黃塊根受到連作脅迫因子的影響, 與脅迫響應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)(如PR蛋白)上調(diào)表達(dá), 而與塊根重要生理代謝過程相關(guān)(如與能量代謝、氨基酸、蛋白質(zhì)代謝相關(guān))和與塊根主要成分合成相關(guān)的蛋白質(zhì)(如與淀粉合成、萜類合成相關(guān))都下調(diào)表達(dá)。

2.3地黃連作下PR-10和SAM合成酶基因表達(dá)量qRT-PCR驗(yàn)證

基于地黃PR-10基因(GenBank登錄號(hào)為EU526395.1)和Actin基因(GenBank登錄號(hào)為EU526396.1)序列, 設(shè)計(jì)了qRT-PCR定量分析的特異引物, 由圖5可以看出, PR-10基因的引物(PR-F、PR-R)與Actin基因的引物(AT-F、AT-R)特異性均較好, 無其他非特異性條帶, 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后均顯示序列正確, 故適合qRT-PCR分析。差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 重茬塊根中PR-10蛋白的表達(dá)豐度顯著高于正茬地黃, 約是正茬的4倍(表1), 而qRT-PCR結(jié)果與之類似, 在轉(zhuǎn)錄水平上, 重茬地黃塊根中PR-10基因的表達(dá)量約是正茬的3.4倍(圖6)。同樣, S-adenosylmethionine (SAM) synthetase的qRT-PCR定量分析結(jié)果也與差異蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果表現(xiàn)一致,均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。

2.4專化型尖孢鐮刀菌的致病性驗(yàn)證及對(duì)地黃PR-10基因表達(dá)量的影響

前期分離篩選的?；图怄哏牭毒軌蚩焖偾趾Φ攸S組培苗生長(zhǎng), 侵染第7天時(shí), 發(fā)現(xiàn)組培苗植株開始表現(xiàn)輕微病害癥狀, 即出現(xiàn)輕微的發(fā)黃枯萎現(xiàn)象; 第9天時(shí), 莖出現(xiàn)倒伏, 葉片嚴(yán)重黃化; 之后癥狀不斷加重, 并且發(fā)病植株上有大量尖孢鐮刀菌菌絲出現(xiàn)(圖7)。

圖6　正茬(NP)和重茬(SM)地黃塊根PR-10和SAM合成酶基因表達(dá)量qRT-PCR驗(yàn)證分析Fig. 6　qRT-PCR analysis of PR-10 and SAM synthetase genes in the newly planting (NP) and monocropping (SM) R. glutinosa roots

圖7　地黃?；图怄哏牭毒秩镜攸S組培苗Fig. 7　Pathogenicity testing of host-specific Fusarium oxysporum isolated

圖8　尖孢鐮刀菌(FON)侵染下地黃組培苗PR-10基因表達(dá)量qRT-PCR驗(yàn)證分析Fig. 8　Quantification of PR-10 gene in tissue culture seedlings of R. glutinosa under F. oxysporum infection

通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)尖孢鐮刀菌侵染下地黃PR-10基因表達(dá)量動(dòng)態(tài)分析, 發(fā)現(xiàn)隨著侵染時(shí)間的增加, 地黃組培苗中PR-10基因的表達(dá)量也不斷增加(圖8), 再次驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果, 說明連作脅迫(如病原菌侵染)下PR-10蛋白顯著上調(diào)表達(dá),參與了地黃連作脅迫的響應(yīng), 推測(cè)田間連續(xù)種植模式下PR-10蛋白上調(diào)表達(dá)可能與連作地黃的根際微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡、病蟲害加重有關(guān)。

3　討論

植物根部是“植物–土壤–微生物”微生態(tài)系統(tǒng)中的一個(gè)重要參與者, 是連接植物地上部與地下部的關(guān)鍵部位, 是土壤微生物影響植物生長(zhǎng)的重要介質(zhì),也是植物感應(yīng)土壤理化性質(zhì)及生物學(xué)特性變化的窗口。研究植物根系在逆境脅迫(如連作脅迫)下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜變化, 可為揭示藥用植物連作障礙形成的機(jī)制及其探索合理有效的消減策略或是進(jìn)行遺傳改良等提供一定的理論依據(jù)。

本研究基于前期優(yōu)化建立的塊根蛋白質(zhì)提取及分離方法, 分別構(gòu)建了正、重茬地黃塊根蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜, 進(jìn)一步通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),連作下地黃塊根蛋白質(zhì)表達(dá)譜明顯變化, 涉及碳水化合物、淀粉代謝、萜類代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、脅迫響應(yīng)以及信號(hào)傳導(dǎo)等代謝途徑(表1)。本研究共鑒定到5個(gè)碳水化合物和能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì), 分別涉及糖酵解(如phosphoglycerate mutase、phosphoglycerate kinase等)、三羧酸循環(huán)(malate dehydrogenase)和氧化磷酸化(NADH-ubiquinone oxidoreductase)。它們?cè)谥夭绲攸S塊根中的表達(dá)量都顯著低于正茬地黃。同時(shí), 發(fā)現(xiàn)3個(gè)淀粉合成和分解代謝相關(guān)的(如UDP-glucose 6-dehydrogenase、phosphoglucomutase等)和1個(gè)萜類化合物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)(4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate synthase)在重茬地黃塊根中都下調(diào)表達(dá)。化學(xué)成分分析表明, 地黃塊根中富含甙類化合物, 其中又以環(huán)烯醚萜甙類(屬于單萜類化合物)為主[11]。本試驗(yàn)鑒定到一個(gè)與萜類化合物骨架合成

相關(guān)的蛋白質(zhì)在連作地黃塊根中其表達(dá)量顯著下降,這可能也是連作下地黃塊根藥效成分含量下降、品質(zhì)降低的一個(gè)重要原因。

本研究還鑒定到1個(gè)核酸合成相關(guān)蛋白質(zhì)(UDP-glucose 4-epimerase)和大部分氨基酸代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)(如serine hydroxymethyltransferase、methionine synthase、S-adenosylmethionine synthase、betaine aldehyd dehydrogenase等), 除Glutamate dehydrogenase 2外, 它們?cè)谥夭绲攸S塊根中都下調(diào)表達(dá)。尤其發(fā)現(xiàn), 鑒定到的3個(gè)S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase)全部下調(diào)表達(dá)(表1和圖6)。S-腺苷甲硫氨酸合成酶是植物細(xì)胞代謝過程中十分關(guān)鍵的一個(gè)酶, 能催化甲硫氨酸和ATP反應(yīng)生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM具有很多重要的生物學(xué)功能, 是細(xì)胞生化反應(yīng)的主要甲基供體, 涉及植物的轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)硫反應(yīng)等重要的生理代謝過程, 這些反應(yīng)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮都至關(guān)重要。SAM也是乙烯及多胺生物合成的前體, 眾所周知乙烯是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑, 參與調(diào)控很多的生理生化反應(yīng), 而多胺在控制植物形態(tài)建成、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高植物抗逆性、延緩衰老等方面發(fā)揮重要功能[12]。與此同時(shí), 本研究還發(fā)現(xiàn)大量與蛋白質(zhì)代謝, 如蛋白質(zhì)翻譯后加工(mitochondrial processing peptidase)、蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的蛋白質(zhì)(如chaperonin CPN60-1、heat shock 70 kD protein、chaperonin containing t-complex protein 1、T-complex protein 1 subunit等)在重茬地黃中全部下調(diào)表達(dá)。伴侶素(chaperonin)是分子伴侶(chaperone)中的一種, 它可以和部分折疊或沒有折疊的蛋白質(zhì)分子結(jié)合, 穩(wěn)定它們的構(gòu)象, 并能引導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊, 形成具有功能的成熟蛋白質(zhì)。伴侶素表達(dá)異常, 可導(dǎo)致很多蛋白質(zhì)無法正確折疊而失去正常功能, 或者在脅迫條件下出現(xiàn)熱休克或失活無法及時(shí)在分子伴侶的協(xié)助下恢復(fù)到其自然狀態(tài), 這就造成細(xì)胞內(nèi)很多關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)異?；蛘呤スδ? 從而引發(fā)不良生理響應(yīng)。可見, 連作下參與植物體內(nèi)重要生理代謝過程的蛋白質(zhì), 如能量代謝、淀粉合成、萜類合成、核酸合成、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)都下調(diào)表達(dá), 導(dǎo)致植物細(xì)胞生理生化反應(yīng)異常, 影響生命活動(dòng)的重要過程和核心途徑,這與連作地黃植株生長(zhǎng)緩慢、根系活力降低、塊根無法正常膨大、藥效成分含量下降等連作癥狀相吻合。

然而, 重茬塊根中與異源物質(zhì)代謝相關(guān)(cytochrome P450)、脅迫響應(yīng)相關(guān)(如pathogenesis-related protein、xylose isomerase、Type IIIa membrane protein cp-wap13、glutamate dehydrogenase 2)、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)(auxin-induced protein)全部上調(diào)表達(dá)。細(xì)胞色素P450 (cytochrome P450)是一類血紅素——硫鐵蛋白, 對(duì)內(nèi)源性和外源性物質(zhì), 尤其是對(duì)環(huán)境有害化學(xué)物質(zhì)具有氧化代謝作用, 它在保護(hù)植物免受有害物質(zhì)侵害方面具有重要作用。研究也發(fā)現(xiàn), 機(jī)械損傷、殺蟲劑、重金屬離子等環(huán)境毒物以及病原菌對(duì)植物細(xì)胞色素P450有明顯的誘導(dǎo)作用[13]。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn), 小麥?zhǔn)艿讲≡鶩usarium asiaticum侵染時(shí), 其細(xì)胞色素P450基因表達(dá)量極顯著上調(diào),并且發(fā)現(xiàn)這與病原真菌產(chǎn)生的毒素DON有關(guān), 可見細(xì)胞色素P450在植物解毒與抵御生物、非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。本研究還發(fā)現(xiàn)2個(gè)與植物細(xì)胞壁合成相關(guān)的基因(xylose isomerase、Type IIIa membrane protein cp-wap13)都上調(diào)表達(dá)。Mao等[15]發(fā)現(xiàn), 鋁毒誘導(dǎo)下, 木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase)顯著上調(diào), 該酶能夠催化D-木酮糖轉(zhuǎn)化為D-木糖, 而D-木糖是半纖維素的主要成分, 這與鋁毒誘導(dǎo)下植物細(xì)胞壁中半纖維素沉積的現(xiàn)象表現(xiàn)一致。研究也報(bào)道, 細(xì)胞壁中的半纖維素和果膠乙?；瘜?duì)植物抵御病原菌侵害有重要作用[16]。另一個(gè)與細(xì)胞壁合成相關(guān)的蛋白——Type IIIa membrane protein cp-wap13屬于reversibly glycosylated polypeptide (RGP)家族,該蛋白與細(xì)胞壁多糖合成相關(guān), 研究發(fā)現(xiàn), 接種Trichoderma harzianum T22的玉米幼苗中該蛋白表達(dá)量上調(diào), 推測(cè)這可能與細(xì)胞壁沉積變厚從而把真菌限制在外表層有關(guān)[17]。與此同時(shí), 本研究還鑒定到一個(gè)病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein 10, PR-10)在重茬地黃塊根中其表達(dá)量顯著上調(diào)。PR蛋白是指由植物寄主基因編碼, 在病理或病理相關(guān)的環(huán)境條件下誘導(dǎo)表達(dá)的一類蛋白質(zhì), 已發(fā)現(xiàn)的PR蛋白可歸為17類, 即PR-1到PR-17, 其中PR-10具有體外核酸酶活性和抗菌活性[18]。PR蛋白的產(chǎn)生與積累是植物體響應(yīng)外界生物、非生物脅迫的重要特征與途徑[19]。已有研究表明, PR-10基因與植物抗病、次生代謝等密切相關(guān)[20], 同時(shí)具有配體(如細(xì)胞分裂素、植物固醇等)結(jié)合能力, 被認(rèn)為在信號(hào)傳遞中發(fā)揮作用[21]。連作下, 地黃塊根中PR-10蛋白表達(dá)量上調(diào)可能與重茬地黃根際的微環(huán)境惡化、病蟲害加重等有密切關(guān)系。本研究還進(jìn)一步運(yùn)用qRTPCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)PR-10蛋白的表達(dá)量變化

加以驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)重茬地黃塊根中的PR-10基因表達(dá)量顯著高于正茬地黃(圖6)。課題組前期研究確實(shí)發(fā)現(xiàn), 地黃連作下土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)惡化, 造成病原微生物(如尖孢鐮刀菌)大量生長(zhǎng)[2,5], 所以本研究也分析了病原菌——尖孢鐮刀菌侵染下地黃組培苗體內(nèi)PR-10基因表達(dá)量的變化, 結(jié)果顯示組培苗PR-10基因能夠明顯被病原菌誘導(dǎo)表達(dá), 且表達(dá)量隨著侵染時(shí)間的增加而逐漸升高(圖8), 驗(yàn)證了差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析的結(jié)果。

4　結(jié)論

前期分離篩選的?；图怄哏牭毒鷮?duì)地黃組培苗有嚴(yán)重的侵染致病作用, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)地黃連作脅迫對(duì)塊根蛋白質(zhì)表達(dá)譜有顯著影響。連作下地黃塊根由于受到了脅迫因子的影響, 如病原菌侵染等, 導(dǎo)致與脅迫響應(yīng)、抵御相關(guān)的蛋白質(zhì)(如pathogenesisrelated protein、cytochrome P450、Type IIIa membrane protein cp-wap13等)上調(diào)表達(dá), 而與塊根重要生理代謝過程相關(guān)(如能量代謝、氨基酸、蛋白質(zhì)代謝)和與塊根主要成分合成相關(guān)的蛋白質(zhì)(如淀粉合成、萜類合成)都下調(diào)表達(dá), 尤其與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的伴侶素(chaperonin)在重茬地黃塊根中全部下調(diào)表達(dá),這可能造成連作地黃生理代謝過程表現(xiàn)異常, 細(xì)胞活性下降, 碳水化合物和能量代謝緩慢, 而且有限的能量都用于抵御外界環(huán)境脅迫, 塊根無法膨大, 藥效成分無法積累, 品質(zhì)下降, 最終表現(xiàn)出障礙效應(yīng)。References

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URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151207.1121.024.html

Comparative Proteomics Analysis of R. glutinosa Tuber Root in Response to Consecutive Monoculture

WU Lin-Kun1,2, CHEN Jun1,2, WU Hong-Miao1,2, WANG Juan-Ying1,2, QIN Xian-Jin1,2, ZHANG Zhong-Yi2, and LIN Wen-Xiong1,2,*
1College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China;2Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

Abstract:Rehmannia glutinosa L. is widely applied in Chinese medicine. However, consecutive monocropping of this plant results in serious decline in both biomass and quality of underground tubers, with poor field performance and insufficient resistance to disease and pest. In the present study, the tuber roots from the newly planted (NP) and consecutively monocropped (SM) R. glutinosa were used through comparative proteomics analysis to study the response of R. glutinosa to consecutive monocropping and the underlying mechanisms of replanting disease. Comparative proteomics analysis showed that these proteins involved in important physiological processes and biosynthese of main components in tuber roots were significantly down-regulated under consecutive monocropping regime. It was also found that chaperonins related to protein folding was down-expressed with the extended monocropping. However, these proteins related to stress response/defense such as pathogenesis-related protein 10, cytochrome P450 and Type IIIa membrane protein cp-wap13 were up-regulated in consecutively monocropped R. glutinosa. Quantitative analysis by qRT-PCR confirmed the up-regulation of PR-10 responding to consecutive monocropping or the infection of pathogenic Fusarium oxysporum. Moreover, PR-10 was gradually up-regulated with the increasing days of infection. In conclusion, consecutive monocropping of R. glutinosa greatly affects the expression profile of proteome in tuber roots. These abnormally expressed proteins might lead to the metabolic disturbances and low energy production. Moreover, the limited energy is applied to

resist the external environmental stresses, resulting in significant decline in the growth of tuber roots and the accumulation of active ingredients.

Keywords:Rehmannia glutinosa; Consecutive monocropping problem; Comparative proteomics; Pathogenesis-related protein; Stress response

收稿日期Received(): 2015-05-27; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-07.

通訊作者*(Corresponding author): 林文雄, E-mail: lwx@fafu.edu.cn

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00243