王 超，陳愛(ài)華，曹 奕，吳楊平，張 雨，姚國(guó)興，蔡永祥

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，南通 226007）

6個(gè)不同海域文蛤地理群體的親緣關(guān)系分析

王 超1，2，陳愛(ài)華2，曹 奕2，吳楊平2，張 雨2，姚國(guó)興2，蔡永祥2

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，南通 226007）

為探究中國(guó)遼東半島海域（遼寧群體）、長(zhǎng)江口及其兩翼海域（江蘇群體）、臺(tái)灣海峽西部海域（福建群體）、珠江口及其兩翼海域（廣東群體）、北部灣海域（廣西群體）以及日本伊勢(shì)灣海域（三重群體）6個(gè)不同海域文蛤（Meretrix meretrix）地理群體的親緣關(guān)系，采用18S rRNA基因、線粒體細(xì)胞色素氧化酶c亞基Ⅰ（COⅠ）及16S rRNA基因3種分子標(biāo)記進(jìn)行序列測(cè)定與分析。測(cè)序結(jié)果顯示，3種基因序列長(zhǎng)度分別在1 854、658、596 bp左右；18S rRNA基因堿基組成無(wú)偏異，序列較為保守；COⅠ與16S rRNA基因A＋T平均含量明顯大于G＋C含量，符合線粒體基因組成特征。通過(guò)MegAlign軟件比對(duì)6個(gè)地理群體文蛤，序列相似百分比分別為99.7%～100.0%（18S）、91.7%～99.8%（COⅠ）、90.2%～99.8%（16S），其中三重文蛤序列差異最大；以文蛤?qū)俚暮熚母颍∕eretrix lyrata）作外群，采用MEGA 5.03軟件中相鄰連接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，我國(guó)沿海5個(gè)文蛤群體聚為一枝且與日本三重文蛤分開，自展值分別為67%（18S）、99%（COⅠ）、98%（16S）；我國(guó)沿海5個(gè)文蛤群體中，遼寧、江蘇、福建文蛤群體首先聚在一起，其次是廣西文蛤群體，最后是廣東文蛤群體。研究結(jié)果表明，遼寧、江蘇、福建文蛤群體同源性較高，親緣關(guān)系最近；廣西文蛤群體、廣東文蛤群體與我國(guó)其它文蛤群體間遺傳差異較大，地理遺傳分化明顯；而日本三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤可定為文蛤的2個(gè)地理亞種。

文蛤；18S rRNA基因；COⅠ基因；16S rRNA基因；系統(tǒng)發(fā)育

文蛤（Meretrix meretrix Linnaeus）隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），簾蛤目（Veneroida），簾蛤科（Veneridae），文蛤?qū)?，為廣溫、廣鹽性灘涂埋棲型雙殼貝類，廣泛分布于中國(guó)、日本、朝鮮、印度等國(guó)家。文蛤肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，其生物活性成分具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂等功效［1］，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前我國(guó)文蛤養(yǎng)殖以野生苗種或近親繁育苗種為主，隨著累代養(yǎng)殖，近交衰退、種質(zhì)下降等現(xiàn)象明顯，導(dǎo)致養(yǎng)殖文蛤生長(zhǎng)速度減慢、抗逆力下降。加之，不同海域天然苗種異地移養(yǎng)，促使不同遺傳背景文蛤群體基因交流增強(qiáng)，對(duì)文蛤增養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展十分不利。因此，文蛤種質(zhì)資源研究與良種選育工作亟需開展，而從分子水平了解不同海域文蛤的遺傳背景，可為以上工作的開展提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

目前關(guān)于我國(guó)文蛤群體間遺傳多樣性的研究，主要集中在局部地區(qū)或少數(shù)群體之間［2－5］。而我國(guó)海岸線漫長(zhǎng)且地形復(fù)雜，文蛤在南北沿海均有分布，要想全面了解文蛤種質(zhì)資源狀況，必須擴(kuò)大研究范圍，搜集足夠多的文蛤群體。馮建彬等［6］曾采用RAPD技術(shù)對(duì)我國(guó)遼寧、山東、江蘇、福建、廣東、廣西文蛤群體進(jìn)行遺傳分析，為文蛤的種質(zhì)資源利用提供了參考。但近十年來(lái)，我國(guó)文蛤增養(yǎng)殖業(yè)迅速擴(kuò)張，異地移養(yǎng)、人工育種等可能對(duì)不同地區(qū)文蛤的遺傳背景產(chǎn)生影響，對(duì)當(dāng)前我國(guó)文蛤種質(zhì)資源狀況需重新認(rèn)識(shí)。日本文蛤具有色澤艷麗、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)良性狀，且與我國(guó)文蛤有較高的雜交配合力［7］，有望成為我國(guó)文蛤良種選育的優(yōu)勢(shì)材料之一。因此，本文以我國(guó)遼寧丹東、江蘇南通、福建長(zhǎng)樂(lè)、廣東珠海、廣西北海和日本三重6個(gè)地理群體文蛤?yàn)檠芯繉?duì)象，采用細(xì)胞核18S rRNA基因及線粒體COⅠ、16S rRNA基因3種分子標(biāo)記，希望能夠較為全面地了解不同海域文蛤的種質(zhì)資源狀況，通過(guò)比較日本三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤的遺傳差異，為我國(guó)文蛤良種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)用文蛤?yàn)?014年10月采自江蘇省文蛤良種場(chǎng)保存的不同地理群體文蛤，采集信息見(jiàn)表1。6個(gè)地理群體文蛤分別來(lái)自于中國(guó)遼東半島海域遼東丹東（遼寧群體）、長(zhǎng)江口及其兩翼海域江蘇南通（江蘇群體）、臺(tái)灣海峽西部海域福建長(zhǎng)樂(lè)（福建群體）、珠江口及其兩翼海域廣東珠海（廣東群體）、北部灣海域廣西北海（廣西群體）及日本伊勢(shì)灣海域三重（三重群體），具體采集地見(jiàn)圖1。各群體均取20 ind個(gè)體，殼長(zhǎng)約4 cm。采活體至實(shí)驗(yàn)室解剖，取閉殼肌組織，保存于95%的酒精中。

表1 不同地理群體文蛤樣品采集信息Tab.1 Information of different populations of M.meretrix

圖1 樣本采集地理分布圖（▲代表采樣地點(diǎn)）Fig.1 Geographic distribution of sam pling sites（▲shows a samp ling site）

1.2 DNA提取

取閉殼肌組織，采用傳統(tǒng)的酚/氯仿法提取總DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物測(cè)序

18S rRNA基因參考程漢良等［8］的方法設(shè)計(jì)3對(duì)引物分別擴(kuò)增18S rRNA基因全序列的3個(gè)基因片段，再拼接為全序列；COⅠ基因采用無(wú)脊椎動(dòng)物通用引物；16S rRNA基因引物參考ANDERSON［9］的序列。引物序列見(jiàn)表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行，體系設(shè)置25μL。體系組成：模板DNA（50 ng· μL－1）1μL；上下游引物各1μL；10×PCR buffer 2.5μL；dNTP（2.5 mM）2μL；MgCl2（25 mM）2 μL；Taq DNA聚合酶（5 U·μL－1）0.4μL；ddH2O補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)條件設(shè)定：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，58℃（18S）、52℃（COⅠ）、46℃（16S）退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，UV照射下割膠，Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒回收純化。挑選效果理想的PCR純化產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司使用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 序列分析

正反向序列用DNAStar Package（version 7.1.0）中的Seqman軟件組裝，結(jié)合測(cè)序峰圖進(jìn)行人工校正。18S rRNA基因3個(gè)基因片段根據(jù)其重疊部分拼接為全序列。最終每個(gè)群體均得到18S rRNA、COⅠ、16S rRNA基因3條序列，用Editseq軟件編輯和分析，并除去兩端的引物部分。通過(guò)NCBI的Blast比對(duì)，驗(yàn)證所得序列均為目的基因。MegAlign軟件比對(duì)序列，計(jì)算序列相似百分比與差異百分比。MEGA（version 5.03）分析堿基組成，計(jì)算變異位點(diǎn)數(shù)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)，轉(zhuǎn)換（si）、顛換（sv）位點(diǎn)數(shù)及其比率（si/sv），并根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離。以文蛤?qū)伲∕eretrix）的簾文蛤（Meretrix lyrata）相應(yīng)序列作外群，GenBank序列號(hào)：JN996715.1（18S），JN898944.1（COⅠ），JN969948.1（16S），采用NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對(duì)

對(duì)6個(gè)群體文蛤基因序列分析顯示，18S rRNA基因堿基平均含量分別是T 24.0%、C 24.2%、A 23.7%、G 28.1%、A＋T 47.7%（表3）。日本三重文蛤的序列長(zhǎng)度為1 849 bp，而我國(guó)沿海5個(gè)地理群體文蛤的序列長(zhǎng)度均為1 854 bp，兩者相差5 bp是因?yàn)樵谖稽c(diǎn)231～235處存在5個(gè)堿基的插入/缺失（圖2）。由于18S rRNA基因具有較高的保守性，三重文蛤與我國(guó)文蛤僅有1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生顛換（G/T），我國(guó)文蛤各群體間無(wú)變異發(fā)生。

COⅠ基因堿基平均含量為T 45.4%、C 13.6%、A 20.6%、G 20.4%、A＋T 66.0%（表3）。序列不存在堿基的插入/缺失，長(zhǎng)度均為658 bp（圖3），共有73個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)30個(gè)，平均轉(zhuǎn)換位點(diǎn)29個(gè)，平均顛換位點(diǎn)2個(gè)，比值R＝si/sv＝13.12。變異位點(diǎn)大多發(fā)生于密碼子的第三位，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，COⅠ基因編碼的219個(gè)氨基酸中只有3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異。

16S rRNA基因堿基平均含量T 37.0%、C 12.0%、A 28.9%、G 22.2%、A＋T 65.9%（表3）。序列共出現(xiàn)15個(gè)堿基的插入/缺失，分布于250～360之間的7個(gè)位點(diǎn)，三重文蛤、廣東文蛤、福建文蛤、廣西文蛤、遼寧文蛤、江蘇文蛤的序列長(zhǎng)度依次為597、593、595、596、596、596 bp（圖4），共有變異位點(diǎn)71個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)11個(gè)，平均轉(zhuǎn)換位點(diǎn)20個(gè)，平均顛換位點(diǎn)7個(gè)，比值R＝si/sv＝2.94。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

表3 不同地理群體文蛤18S rRNA、16S rRNA和COⅠ基因片段堿基組成百分比Tab.3 The base com position（%）of 18S rRNA，16S rRNA and COⅠgene fragments in different populations of M.meretrix （%）

圖2 不同地理群體文蛤18S rRNA基因序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment of partial 18S rRNA gene fragment in different populations of M.meretrix

用MegAlign軟件采用Jotun Hein方法對(duì)6個(gè)文蛤群體的18S rRNA基因、COⅠ基因及16S rRNA基因序列分別進(jìn)行比對(duì)，序列相似百分比與差異百分比見(jiàn)表4。18S rRNA基因序列三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤差異百分比為0.3%，我國(guó)各群體間相似百分比均達(dá)100.0%。COⅠ基因序列6個(gè)文蛤群體相似百分比91.7%～99.8%，三重文蛤與我國(guó)文蛤差異均達(dá)8.0%及以上，我國(guó)遼寧、江蘇、福建文蛤群體之間序列相似度較高，與廣西、廣東文蛤群體差異相對(duì)較大。16S rRNA基因序列6個(gè)群體相似百分比90.2%～99.8%，三重文蛤與我國(guó)文蛤差異度水平均達(dá)10.0%以上，序列相似度也是遼寧、江蘇、福建文蛤群體較高，其次是廣西、廣東文蛤群體。3種基因序列分析結(jié)果較為一致，我國(guó)遼寧、江蘇、福建文蛤群體同源性較高，與廣西、廣東文蛤之間差異明顯，三重文蛤與我國(guó)文蛤間基因序列差異最大。

圖3 不同地理群體文蛤COⅠ基因序列比對(duì)Fig.3 Sequence alignment of partial COⅠgene fragment in different populations of M.meretrix

表4 基于Jotun Hein法計(jì)算6個(gè)地理群體文蛤18S rRNA基因、COⅠ基因、16S rRNA基因序列相似百分比與差異百分比Tab.4 Percentage of sequence identity and divergence of 18S rRNA，16S rRNA and COⅠgene in different populations of M.meretrix by Jotun Hein method （%）

用MegAlign軟件采用Jotun Hein方法對(duì)6個(gè)文蛤群體的18S rRNA基因、COⅠ基因及16S rRNA基因序列分別進(jìn)行比對(duì)，序列相似百分比與差異百分比見(jiàn)表4。18S rRNA基因序列三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤差異百分比為0.3%，我國(guó)各群體間相似百分比均達(dá)100.0%。COⅠ基因序列6個(gè)文蛤群體相似百分比91.7%～99.8%，三重文蛤與我國(guó)文蛤差異均達(dá)8.0%及以上，我國(guó)遼寧、江蘇、福建文蛤群體之間序列相似度較高，與廣西、廣東文蛤群體差異相對(duì)較大。16S rRNA基因序列6個(gè)群體相似百分比90.2%～99.8%，三重文蛤與我國(guó)文蛤差異度水平均達(dá)10.0%以上，序列相似度也是遼寧、江蘇、福建文蛤群體較高，其次是廣西、廣東文蛤群體。3種基因序列分析結(jié)果較為一致，我國(guó)遼寧、江蘇、福建文蛤群體同源性較高，與廣西、廣東文蛤群體之間差異明顯，三重文蛤與我國(guó)文蛤間基因序列差異最大。

2.2 遺傳距離與系統(tǒng)發(fā)育

用MEGA軟件根據(jù)Kimura 2-parametermodel計(jì)算包括外群在內(nèi)的遺傳距離（D），用Bootstrap方法（1 000 replications）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差。由18S rRNA基因計(jì)算得出的遺傳距離中（表5），三重文蛤與我國(guó)文蛤的遺傳距離D＝0.001，與簾文蛤之間D＝0.007；我國(guó)文蛤群體間遺傳距離為0，與簾文蛤之間D＝0.008。

有研究表明，簾蛤科貝類DNA條形碼間隙區(qū)為0.040～0.100［10］。本研究根據(jù)COⅠ基因得出的遺傳距離中（表6），三重文蛤與我國(guó)江蘇（0.084）、廣西（0.091）、遼寧（0.080）、福建（0.082）、廣東（0.087）文蛤群體遺傳距離處于間隙區(qū)內(nèi)且靠近0.100水平，已接近屬內(nèi)種間差異；我國(guó)江蘇、廣西、福建、遼寧文蛤群體之間遺傳距離0.006～0.028，皆小于條形碼間隙0.040水平，即屬于種內(nèi)差異；廣東文蛤群體與江蘇、遼寧、福建文蛤群體遺傳距離（0.066）處于間隙區(qū)且靠近0.040，與廣西文蛤群體距離0.036，可視為種內(nèi)差異。

16S rRNA基因中（表7），三重文蛤與我國(guó)文蛤遺傳距離為0.092～0.098；我國(guó)遼寧、江蘇、福建、廣西文蛤群體遺傳距離較?。?.003～0.016），與廣東文蛤群體遺傳距離為0.039～0.054。THORP［11］提出群體間16S rRNA基因的遺傳距離是0.030～0.200，可見(jiàn)6個(gè)文蛤群體遺傳差異并沒(méi)有達(dá)到種間水平，遼寧、江蘇、福建文蛤群體甚至低于群體間水平。

圖4 不同地理群體文蛤16S rRNA基因序列比對(duì)Fig.4 Sequence alignment of partial 16S rRNA gene fragment in different populations of M.meretrix

表5 6個(gè)地理群體文蛤及外群18S rRNA基因序列之間的遺傳距離和標(biāo)準(zhǔn)誤差Tab.5 Genetic distances（D）and corresponding standard errors of 18S rRNA gene among six populations of M.meretrix and outgroup

表6 6個(gè)地理群體文蛤及外群COⅠ基因序列之間的遺傳距離和標(biāo)準(zhǔn)誤差Tab.6 Genetic distances（D）and corresponding standard errors of COⅠgene among six populations of M.meretrix and outgroup

表7 6個(gè)地理群體文蛤及外群16S rRNA基因序列之間的遺傳距離和標(biāo)準(zhǔn)誤差Tab.7 Genetic distances（D）and corresponding standard errors of 16S rRNA gene am ong six populations of M.meretrix and outgroup

以簾文蛤作外群，采用相鄰連接法（NJ法）分別構(gòu)建不同海域文蛤18S rRNA基因、COⅠ基因、16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，節(jié)點(diǎn)數(shù)值表示Bootstrap 1 000次檢驗(yàn)自展值。18S rRNA基因序列NJ樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示（圖5），6個(gè)地理群體文蛤首先聚為一枝與外群分開；文蛤種群中，我國(guó)沿海文蛤聚為一枝與三重文蛤分開，得到67%的支持率。COⅠ基因與16S rRNA基因序列的NJ樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致（圖6－7），首先是6個(gè)文蛤種群聚為一枝與外群分開；其次我國(guó)沿海文蛤聚為一枝與三重文蛤分開，自展值分別高達(dá)99%（COⅠ）與98%（16S）；我國(guó)不同地區(qū)文蛤中，遼寧、江蘇、福建文蛤群體親緣關(guān)系較近聚在一起，自展值分別是65%（COⅠ）與97%（16S），其次是廣西文蛤群體，最后是廣東文蛤群體。

圖5 基于18S rRNA基因序列的不同地理群體文蛤NJ樹（K imura 2-parameter model，1 000 replications）Fig.5 NJ phylogenetic tree based on 18S rRNA gene of different populations of M.meretrix

圖6 基于COⅠ基因序列的不同地理群體文蛤NJ樹（K imura 2-parameter model，1 000 replications）Fig.6 NJ phylogenetic tree based on COⅠgene of different populations of M.meretrix

圖7 基于16S rRNA基因序列的不同地理群體文蛤NJ樹（K imura 2-parameter model，1 000 replications）Fig.7 NJ phylogenetic tree based on 16S rRNA gene of different populations of M.meretrix

2.3 不同文蛤群體的親緣關(guān)系

由以上分析可知，我國(guó)沿海遼寧、江蘇、福建文蛤群體遺傳分化低于地理群體間變異水平，親緣關(guān)系最近；廣西文蛤群體、廣東文蛤群體與我國(guó)其它文蛤群體間遺傳差異較大，地理遺傳分化明顯；日本三重文蛤與我國(guó)文蛤之間3種基因序列均有較大差異，按照簾蛤科貝類0.040～0.100條形碼間隙以及16S rRNA基因群體間0.030～0.200的遺傳距離，三重文蛤與我國(guó)文蛤之間超出種內(nèi)分化但未達(dá)到種間水平，可認(rèn)為二者達(dá)到地理亞種分化，3種基因序列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)均把我國(guó)文蛤群體聚為一枝與三重文蛤分開，且可信度較高，也支持把三重文蛤與我國(guó)文蛤定為文蛤的2個(gè)地理亞種。

3 討論

3.1 3種分子標(biāo)記相結(jié)合應(yīng)用于文蛤種群的親緣關(guān)系分析

18S rRNA基因在生物體內(nèi)含量較大且在進(jìn)化過(guò)程中具有保守性，適合不同層次系統(tǒng)發(fā)育的研究；COⅠ基因是線粒體氧化呼吸鏈的重要成員，基因變異較大；16S rRNA基因是非編碼蛋白質(zhì)基因，不受密碼子編碼的選擇壓力影響，進(jìn)化速度適中。本研究結(jié)合18S rRNA基因、COⅠ與16S rRNA基因分析不同地理群體文蛤的遺傳差異，利用3種基因序列不同的保守性，在聚類分析中得到了一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，能夠有效反映不同地理群體文蛤的親緣關(guān)系。根據(jù)本文研究，18S rRNA基因堿基平均含量分別是T 24.0%、C 24.2%、A 23.7%、G 28.1%，4種堿基基本無(wú)偏異，與程漢良等［8］發(fā)表的簾蛤科貝類堿基組成一致；COⅠ與16S rRNA基因堿基A＋T含量明顯高于G＋C含量，符合線粒體基因組成特征。COⅠ基因共有73個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)30個(gè)，16S rRNA基因有71個(gè)變異位點(diǎn)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)11個(gè)，表明16S rRNA基因比COⅠ基因序列保守，與頭足綱（Cephalopoda）［12］、鮑科（Haliotidae）［13］等多個(gè)研究結(jié)果一致。

3.2 日本三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤之間遺傳分化已達(dá)到亞種水平

DNA條形碼是HEBERT等［14］提出的一種基于COⅠ基因進(jìn)行物種鑒定的分子技術(shù)。隨著研究的深入，HEBERT等［15］、BURNS等［16］提出以條形碼間隙（種內(nèi)基因序列的最大遺傳距離與種間基因序列的最小遺傳距離之間的空隙）界定物種。陳軍［10］在簾蛤科貝類的DNA條形碼研究中，把0.040～0.100定義為簾蛤科的條形碼間隙，據(jù)此將315個(gè)樣品中的289個(gè)成功鑒定到種，并在BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中驗(yàn)證了此間隙區(qū)的存在。因此，本研究以0.040～0.100的條形碼間隙探討不同群體文蛤的親緣關(guān)系是合理的。

在以往的研究中，DNA序列差異通常也被用來(lái)鑒定物種。有研究表明，馬蹄螺科（Trochidae）屬內(nèi)種間COⅠ基因序列差異為5.7%～12.1%［17］；珍珠蚌科（Margaritiferidae）屬內(nèi)種間COⅠ基因序列差異11.57%～12.33%［18］。簾蛤科貝類的研究中，波紋巴非蛤（P.undulata）與織錦巴非蛤（P.textile）16S rRNA基因序列差異7.8%～8.0%，薄片鏡蛤（D.corrugate）與薄殼鏡文蛤（D.angulosa）序列差異為10.7%，兩者都被認(rèn)為是相互獨(dú)立的種，防城港文蛤與其它地理群體文蛤COⅠ基因序列差異達(dá)到6.6%，被研究者認(rèn)為具有兩個(gè)地理亞種的可能性［19］。本研究中日本三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤COⅠ基因序列平均差異8.4%，16S rRNA基因序列平均差異10.4%，已接近種間分化水平。在聚類分析中，COⅠ基因與16S rRNA基因具有高度一致性，我國(guó)5個(gè)地理群體文蛤聚在一起，可信度達(dá)到99%（COⅠ）、98%（16S），三重文蛤則單獨(dú)形成一個(gè)分枝，即使在保守性較高的18S rRNA基因聚類中，三重文蛤也單獨(dú)形成一枝與我國(guó)沿海文蛤分開。

綜上，作者認(rèn)為可將三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤定為文蛤的2個(gè)地理亞種。吳楊平等［20］基于形態(tài)分析研究認(rèn)為，日本三重文蛤與麗文蛤（Meretrix cusoria）相近，應(yīng)為麗文蛤，并與福建長(zhǎng)樂(lè)麗文蛤達(dá)到亞種水平。而潘寶平等［21］、CHEN等［22］、程漢良等［19］的研究則支持將麗文蛤訂為文蛤的同物異名或地理亞種的觀點(diǎn)。因此，本文將日本三重文蛤與我國(guó)沿海文蛤定為文蛤的2個(gè)地理亞種的結(jié)論與上述研究有一定的相似之處。

3.3 我國(guó)文蛤種質(zhì)資源的現(xiàn)狀與保護(hù)

馮建彬等［6］的研究結(jié)果顯示，遼寧、山東、江蘇文蛤群體親緣關(guān)系較近，其次是福建、廣西、廣東群體。而在本研究中，福建文蛤群體與遼寧、江蘇文蛤群體聚在一起，其次是廣西、廣東群體，可見(jiàn)福建文蛤群體與遼寧、江蘇文蛤群體間親緣關(guān)系增近，我國(guó)其它文蛤群體間親緣關(guān)系并未發(fā)生較大改變。福建與遼寧、江蘇文蛤群體可能是由于近些年異地移養(yǎng)、苗種引入等造成了種質(zhì)混雜，其它文蛤群體種質(zhì)保護(hù)較好。日本三重縣（伊勢(shì)灣）與我國(guó)存在地理隔離，兩地氣候及海水理化因子差異較大，長(zhǎng)期的自然選擇造成三重文蛤與我國(guó)文蛤達(dá)到亞種分化。為保證我國(guó)文蛤種質(zhì)資源的可持續(xù)利用及增養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，必須加強(qiáng)實(shí)施保護(hù)與改良措施，如：文蛤的增養(yǎng)殖中應(yīng)避免近親繁殖，減少累代養(yǎng)殖；合理引種，文蛤異地移養(yǎng)要嚴(yán)格監(jiān)管，避免對(duì)當(dāng)?shù)刈匀环N群的基因污染；開展文蛤種質(zhì)資源調(diào)查工作，對(duì)未受污染的種群建立種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)，對(duì)野生種已經(jīng)大量減少的海域進(jìn)行保種及人工增殖。

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Genetic relationship analysis of six Meretrix meretrix populations from different sea areas

WANG Chao1，2，CHEN Ai-hua2，CAO Yi2，WU Yang-ping2，ZHANG Yu2，YAO Guo-xing2，CAIYong-xiang2
（1.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306；2.Jiangsu Marine Fisheries Research Institute，Nantong226007）

In this paper，18S ribosomal RNA gene，mitochondrial cytochrome oxidase c subunit I（COⅠ）gene and 16S rRNA gene sequences of six differentMeretrixmeretrixpopulations from Liaodong Peninsula sea area（Liaoning population），the Yangtze Estuary and its twowing sea areas（Jiangsu population），Western sea area of Taiwan Strait（Fujian population），Pearl River Estuary and its two wing sea areas（Guangdong population），Beibu Bay sea area（Guangxi population）and Ise Bay sea area，Japan（Mie population）were sequenced and analyzed to study their genetic relationship.The genetic background of differentMeretrix meretrixpopulations was analyzed in molecular level，to provide theoretical basis for germplasm resources research and breeding.Results of sequence analysis showed that：the length of three genetic sequences was about 1 854 bp，658 bp and 596 bp respectively；base composition of18S rRNA genewas unbiased，and its sequence was conservative；COⅠgene had 73 variable sites，among which 30 were parsim-informative sites，the average content of A＋T was 66.0%；16S rRNA gene had 71 variable sites，among which 11 were parsim-informative sites，the average contentof A＋Twas65.9%.A＋T contentwas obviously higher than G＋C content in bothCOⅠand 16S rRNA gene，which was in accordance with features of mitochondrial genes.Gene sequences of sixMeretrix meretrixpopulations were aligned by MegAlign，the percentage of sequence identity was 99.7%－100.0%（18S），91.7%－99.8%（COⅠ），90.2%－99.8%（16S）respectively.Meretrix meretrixfrom Mie had the largest difference.Phylogenetic trees were constructed by MEGA5.03 using adjacent connection method（NJ）with Meretrix lyrata as outgroup.Five Meretrix meretrix populations from China coast areas were clustered into one clade and separated fromMeretrix meretrixfrom Mie，Japan，bootstrapping value was 67%（18S），99%（COⅠ）and 98%（16S）respectively；among the five populations from China coast areas，Meretrix meretrixfrom Liaoning，Jiangsu，F(xiàn)ujian clustered together first，and then the population from Guangxi，the last was the population from Guangdong.Results indicated that：Meretrixmeretrixfrom Liaoning，Jiangsu，F(xiàn)ujian had a higher homology and their genetic relationship was the closest；a larger genetic difference was found amongMeretrixmeretrixfrom Guangxi，Guangdong and other populations from China，and their geographic genetic differentiation was obvious；Meretrixmeretrixfrom Mie，Japan and China coast areas could be described as two geographic subspecies.

Meretrixmeretrix；18S rRNA gene；COⅠgene；16S rRNA gene；phylogeny

Q 951

A

1004－2490（2016）03－0262－11

2015－09－12

江蘇省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（BE2015324）；江蘇省水產(chǎn)三新工程重大項(xiàng)目（D2014-16）；江蘇省屬公益類科研院所能力提升項(xiàng)目（BM2015017）；江蘇省水產(chǎn)良種保種和親本更新項(xiàng)目（BZ2014，2015）；南通市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（HL2014007）

王 超（1990－），男，河南信陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事貝類增養(yǎng)殖學(xué)研究。

E-mail：wangchao7198＠163.com

陳愛(ài)華，研究員。Tel：0513-85228272，E-mail：chenah540540＠aliyun.com