王德國， 劉海英,王愛萍

(1.許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南省博士后研發(fā)基地，河南 許昌 461000；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的應(yīng)用研究進展

王德國1， 劉海英1,王愛萍2

(1.許昌學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南省博士后研發(fā)基地，河南 許昌 461000；2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

主要論述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)生假陽性的兩個可能原因以及圍繞這兩個方面國內(nèi)外的研究動態(tài),從而為解決環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的應(yīng)用瓶頸提供理論基礎(chǔ).

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；假陽性；氣溶膠污染；非特異性擴增

日本學(xué)者Notomi 等在2000年發(fā)明報道了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)[1]，截至目前該報道已被英文論文引用2 199次，該技術(shù)通過多對引物實現(xiàn)巧妙的擴增，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)效率非常高.由于無溫度變化的耗時，2002年環(huán)引物的提出又進一步縮短了反應(yīng)時間[2]，所以環(huán)介導(dǎo)等溫擴增在反應(yīng)速度、特異性、靈敏度方面優(yōu)于鏈式聚合酶反應(yīng)(PCR)[3-4]、核酸序列依賴性擴增(NASBA)[5-6]、鏈替代擴增反應(yīng)(SDA)[7]、滾換擴增反應(yīng)(RCA)[8]和解鏈酶擴增(HAD)[9].然而，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)雖然經(jīng)過近十五年的研究開發(fā)，仍然沒有實際應(yīng)用，主要是由于這種分子生物學(xué)檢測方法假陽性率高.起初絕大多數(shù)研究人員認為氣溶膠污染是產(chǎn)生假陽性的主要原因，所以大部分研究都是圍繞氣溶膠污染問題展開的，研究擴增產(chǎn)物檢測方法，以實現(xiàn)不開蓋檢測；現(xiàn)在人們都認為非特異性擴增是引起假陽性的主要原因，所以解決非特異性擴增問題逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點.

1 擴增結(jié)果的判讀方法研究

1.1 電泳法

擴增后用2%瓊脂糖電泳分析擴增產(chǎn)物[10-11]，但電泳法需要用高致癌性的熒光染料,如溴化乙錠等，既危害操作人員的健康，又會產(chǎn)生所謂的氣溶膠污染[12].

1.2 濁度法

通過擴增產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸根與鎂離子形成的沉淀物，用肉眼觀察擴增體系的渾濁度來判斷擴增結(jié)果[13]，由于擴增反應(yīng)產(chǎn)生的渾濁度不明顯，所以濁度法檢測容易受檢測人員主觀因素的影響.

1.3 熒光染料法

擴增反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入SYBR Green I、PicoGreen等類似的熒光染料[14-15]，通過熒光強度的變化，判斷擴增結(jié)果.熒光染料法主要是基于擴增產(chǎn)物DNA進行檢測，染料分子插入到DNA雙螺旋中熒光強度增大，進而判斷擴增結(jié)果，而LAMP反應(yīng)需要多對引物，引物二聚體的產(chǎn)生是難以避免的，也就無法排除二聚體引起的假陽性問題[16-17]，并且擴增后開蓋加入熒光染料還易引起氣溶膠污染.

1.4 金屬離子指示劑

為了避免上述熒光染料對擴增結(jié)果的誤判，日本榮研化學(xué)株式會社采用鈣黃綠素檢測副產(chǎn)物焦磷酸根來判斷擴增結(jié)果[18]，在一些報道中還采用金屬離子指示劑羥基萘酚藍來判斷擴增結(jié)果[19-20]，這些金屬離子指示劑可以提前加入到反應(yīng)體系中，就實現(xiàn)了不開蓋檢測.

1.5 免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰?/p>

通常采用生物素和異硫氰酸熒光素分別標記環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的引物，擴增后采用印有生物素親和蛋白(avidin)及異硫氰酸熒光素抗體的試紙條檢測[21].免疫側(cè)向?qū)游鲈嚰埿枰獢U增反應(yīng)后開蓋上樣層析，由于擴增后產(chǎn)物量為109，開蓋后容易引起氣溶膠污染，從而降低實用性.

有一種商業(yè)化銷售的產(chǎn)品融合了恒溫擴增、核酸雜交、核酸試紙條三種技術(shù)，既克服了氣溶膠污染，又避免了引物二聚體引起的假陽性問題.

1.6 實時濁度儀法

通過實時濁度儀如LA-320c監(jiān)控反應(yīng)過程，判斷擴增結(jié)果[22].但目前實時濁度儀的市場價格40萬左右，遠高于PCR儀的價格，就限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用.

目前該領(lǐng)域的科研工作者普遍認為環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)靈敏度高，容易產(chǎn)生氣溶膠污染，交叉污染是導(dǎo)致假陽性率高的主要原因，所以在實現(xiàn)不開蓋檢測方面做了大量研究與嘗試，擴增產(chǎn)物的檢測手段近乎完美，尤其是最近提出的巨磁阻檢測方法[23]，但環(huán)介導(dǎo)等溫擴增還不能實際應(yīng)用.

2 非特異性擴增研究

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增通過多對引物實現(xiàn)巧妙擴增，使用多對引物難免會形成引物二聚體和出現(xiàn)非特異性擴增，特別是在環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)中引物、鎂離子、dNTP和酶的濃度比Real-time PCR中的高出好幾倍.在Real-time PCR研究中，為了避免非特性擴增,需要嚴格控制并優(yōu)化這四個因素的濃度，越來越多的研究人員認為,導(dǎo)致環(huán)介導(dǎo)等溫擴增假陽性率高的主要原因是引物二聚體引起的非特異性擴增.

早在2009年，Sulong Li等研究應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測食源性致病菌志賀氏菌，設(shè)計了兩套引物，其中一套存在非特異性擴增，首次提出了環(huán)介導(dǎo)等溫擴增中非特異性擴增的現(xiàn)象，強調(diào)了引物設(shè)計的重要性，并對引物篩選提出了一些實用性建議[24].Sulong Li等提出了LAMP檢測方法的相對特異性觀點，揭示了非特異性擴增是引起假陽性的主要原因，而非實驗污染，相關(guān)研究成果獲2009年中國國家質(zhì)檢總局科技興檢三等獎[25].

為了降低非特異性擴增反應(yīng)，Gandelman等嘗試采用莖引物(Stem Primers)替代環(huán)引物(Loop Primers)改進環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，指出環(huán)引物比莖引物更容易引起引物二聚體間的相互反應(yīng)和非特異性擴增[26].孟兆祥等提出了一種DNA擴增的新方法，利用熱穩(wěn)定的Bst DNA聚合酶驅(qū)動跨越式滾環(huán)等溫擴增反應(yīng)，嘗試從另外一個角度解釋環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)中的假陽性反應(yīng)[27].

3 展望

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)主要的應(yīng)用瓶頸是假陽性率高，可能的原因包括氣溶膠污染和非特異性擴增，目前氣溶膠污染引起的假陽性問題已經(jīng)解決，因此如何解決非特異性擴增產(chǎn)生的假陽性問題就成為研究熱點.該問題一旦解決，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)必將成為檢測領(lǐng)域一個強有力的分子生物學(xué)診斷手段.

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責(zé)任編輯：衛(wèi)世乾

Progress in Research and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification

WANG De-guo1， LIU Hai-ying1, WANG Ai-ping2

(1.HenanPostdoctoralResearchBase,FoodandBioengineeringCollege,XuchangUniversity,Xuchang461000,China；2.LifeScienceCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

We discussed two potential reasons for the false positive in loop-mediated isothermal amplification and research trend at home and abroad on these two aspects,providing theoretical basis for the solutions to the bottleneck problem in loop-mediated isothermal amplification.

loop-mediated isothermal amplification; false positive; aerosol pollution; non-specific amplification

2015-02-23

國家人力資源和社會保障部留守人員科技活動項目；河南省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃(15IRTSTHN016)；河南省人社廳博士后研發(fā)基地項目；許昌市科技發(fā)展計劃項目(1504005)

王德國(1975—)，男，山東菏澤人，副教授，博士，研究方向：食源性致病微生物分子生物學(xué)快速檢測方法.

1671-9824(2016)02-0069-04

Q81

A