高晶，徐彬，郭曉奎，秦金紅

1. 上海交通大學醫(yī)學院，上海 200025； 2. 復旦大學附屬婦產科醫(yī)院，上海 200011； 3. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150

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多重耐藥肺炎克雷伯菌噬菌體KP002的生物學特性及基因組學研究

高晶1,2，徐彬3，郭曉奎1，秦金紅1

1. 上海交通大學醫(yī)學院，上海 200025； 2. 復旦大學附屬婦產科醫(yī)院，上海 200011； 3. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院崇明分院，上海 202150

摘要：以上海某些醫(yī)院臨床分離到的多重耐藥肺炎克雷伯菌為宿主菌，從不同環(huán)境的污水中分離獲得1株肺炎克雷伯菌噬菌體KP002。電子顯微鏡顯示其為有尾噬菌體，頭部直徑約70 nm，尾長約80 nm，尾寬約20 nm。對其生物學特性進行研究，結果顯示此株噬菌體在pH 3～9及4～50 ℃的環(huán)境中具有較高活性；6 min吸附率達95%以上；潛伏期為10 min，爆發(fā)期為50 min；裂解量為172 pfu/cell。結果表明，該噬菌體對pH值和溫度適應范圍較寬。對其全基因組進行測序分析，結果顯示其基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，全長47 173 bp, GC含量為48%。本研究篩選獲得1株對pH值和溫度適應范圍較寬的耐藥肺炎克雷伯菌烈性噬菌體KP002，為建立耐藥肺炎克雷伯菌的噬菌體庫以用于治療臨床多重耐藥菌感染提供了新的思路。

關鍵詞：多重耐藥肺炎克雷伯菌；噬菌體；基因組學

肺炎克雷伯菌是臨床上最常見的重要條件致病菌和醫(yī)源性感染細菌之一[1]，易引起呼吸道、泌尿生殖道及血流感染。肺炎克雷伯菌的耐藥問題已對公共衛(wèi)生構成重大威脅[2]。國外臨床研究顯示，對于耐藥細菌的治療，噬菌體療法具有良好的臨床療效[3]。本研究通過對耐藥肺炎克雷伯菌噬菌體KP0002的生物學特性和基因組學進行分析，為噬菌體用于肺炎克雷伯菌感染的治療提供基礎。

1材料與方法

1.1噬菌體的分離和篩選

將臨床分離獲得的80株產超廣譜β內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBL)和碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌作為宿主菌。從環(huán)境污水中取樣本，在樣本液中加入CaCl2至終濃度1 mmol/L，離心10 min；上清液經0.22 μm孔徑的濾膜過濾后，與上述80株培養(yǎng)至對數(shù)期的混合菌液混合，37 ℃培養(yǎng)過夜；加入少量氯仿，4 ℃離心10 min，取上清液，與培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌株37 ℃孵育10 min，雙層瓊脂法鋪平板，37 ℃培養(yǎng)過夜；將獲得的噬菌斑純化3次，進一步研究。

1.2CsCl不連續(xù)密度梯度離心法純化噬菌體

將噬菌體和宿主菌在含有5 mmol/L CaCl2和MgCl2的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；加入終濃度為0.5 mol/L的NaCl及2%氯仿，混勻后靜置4 ℃過夜。去除氯仿，4 ℃離心15 min，收集上清液，并加入固體PEG8000至終濃度為10%(W/V)，充分溶解后靜置4 ℃過夜。4 ℃離心15 min，去除上清液，收集沉淀并將沉淀重懸于適量的SM緩沖液(NaCl 5.8 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、明膠0.1 g/L、Tris-HCl 50 mL)，加入等量氯仿混勻，靜置分層后離心15 min；去除氯仿層和PEG 8000層，取上清液，4 ℃ CsCl密度梯度離心4 h，吸取目的條帶，4 ℃ SM緩沖液中透析3次，透析好的噬菌體液用于透射電子顯微鏡觀察及DNA 抽提。

1.3噬菌體效價的測定

用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價——噬菌斑形成單位(plaque forming unit，pfu)。將擴增所得的噬菌體液進行連續(xù)10倍稀釋至103~105密度范圍。取400 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的宿主菌和10 μL噬菌體稀釋液混合于試管中，室溫吸附10 min后，雙層瓊脂平板法計算pfu，重復3次。噬菌體效價(pfu/mL)=平均噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×100。

1.4噬菌體宿主譜分析

用雙層瓊脂平板法確定噬菌體的宿主譜。通過噬菌斑的產生判斷噬菌體對細菌的裂解情況。根據(jù)抑菌圈的透明度確定噬菌體對宿主菌的作用強弱。

1.5噬菌體生物學特性

1.5.1酸堿穩(wěn)定性實驗將噬菌體液用SM緩沖液稀釋后，按感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為0.01的比例混合噬菌體和宿主菌，分別在pH為1、2、3、4、5、6、7、7.45、8、9、10、11、12的TM緩沖液中37 ℃水浴1 h，用雙層瓊脂平板法確定噬菌體效價，重復3次。

1.5.2熱穩(wěn)定性實驗將噬菌體液用SM緩沖液稀釋后，按MOI=0.01的比例混合噬菌體和宿主菌，分別于4、37、50、60和 70 ℃水浴中作用1 h，用雙層瓊脂平板法確定噬菌體效價，重復3次。

1.5.3吸附實驗培養(yǎng)宿主菌至對數(shù)期，室溫按MOI=0.000 1的比例混合噬菌體液和菌液。于混合后0、1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60 min各取100 μL加至0.9 mL液體LB培養(yǎng)基中，立即16 000g離心30 s，取50 μL上清液與400 μL宿主菌混合，用雙層瓊脂平板法確定效價，計算吸附至宿主菌的噬菌體，重復3次。

1.5.4感染曲線實驗培養(yǎng)宿主菌至對數(shù)期，按MOI=0、0.1、1 加入噬菌體液，每隔30 min取樣測定600 nm處的光密度(optical density，OD)，計算宿主菌生長情況，重復3次。

1.5.5一步生長曲線測定培養(yǎng)宿主菌至對數(shù)期，按MOI=0.000 1的比例加入噬菌體液，37 ℃孵育10 min，13 000g離心15 min，棄上清液，沉淀重懸于液體LB培養(yǎng)基。重懸后每10 min取樣，用雙層瓊脂平板法確定效價，重復3次。

1.6噬菌體電子顯微鏡觀察

將上述經CsCl不連續(xù)密度梯度離心純化透析后的噬菌體經2%戊二醛固定，磷鎢酸負染，透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)結構。

1.7噬菌體DNA的提取和測序

將上述經CsCl不連續(xù)密度梯度離心純化透析后的噬菌體用λ噬菌體基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)抽提DNA，由上海人類基因組研究中心測序。應用 RAST、 GLIMMER和GeneMarks來預測噬菌體基因組開放閱讀框架(open reading frame，ORF)，并進一步與美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫進行相似性序列比較。

2結果

2.1噬菌體分離及其形態(tài)

從污水樣本中分離得到1株肺炎克雷伯菌烈性噬菌體，命名為KP002。用雙層瓊脂平板法純化3次后，噬菌斑形態(tài)和大小保持均勻一致，斑呈圓形、透明，邊緣清晰，直徑為3~4 mm。經純化后，測定效價為4.05×1010pfu/mL。在電子顯微鏡下觀察，噬菌體KP002由一個多面體對稱的頭部和尾部組成，屬于有尾噬菌體。頭部直徑約為70 nm，尾長約80 nm，尾寬約20 nm(圖1)。

圖1KP002的透射電子顯微鏡圖像

Fig.1Transmission electron micrograph of KP002

2.2宿主譜分析

采用雙層平板法和點滴法，發(fā)現(xiàn)在測試的80株耐藥肺炎克雷伯菌中，KP002對其中10株裂解，裂解率為12.5%，但裂解效果較強。

2.3噬菌體KP002的酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性

2.3.1酸堿穩(wěn)定性KP002酸堿穩(wěn)定性研究顯示，KP002在pH 3～9緩沖液中作用1 h后，仍能保持較高的活性。在pH<2時，噬菌體效價接近于0。在pH>10時，隨著pH值增大，噬菌體活性亦顯著降低。結果表明KP002對酸堿比較穩(wěn)定(圖2)。

2.3.2熱穩(wěn)定性噬菌體KP002在4、37、40、50 ℃水浴中作用1 h后，均能保持較高效價。當溫度高于60 ℃時，效價開始下降；升高至70 ℃時，效價接近于0(圖3)。

圖2KP002的酸堿穩(wěn)定性曲線

Fig.2pH stability curve of KP002

圖3KP002的熱穩(wěn)定性曲線

Fig.3Thermal stability curve of KP002

2.4噬菌體感染宿主菌的能力

2.4.1吸附曲線KP002在室溫下與宿主菌孵育6 min后，有95.22%噬菌體吸附至宿主菌，10 min時吸附率達97.66%(圖4)。

圖4KP002的吸附曲線

Fig.4Adsorption curve of KP002

2.4.2一步生長曲線由一步生長曲線可知(圖5)，KP002的潛伏期約為10 min，裂解期為50 min，之后進入穩(wěn)定期。KP002的溶菌周期為10~60 min。根據(jù)裂解量的計算公式：裂解量=裂解末期噬菌體效價/感染初期噬菌體效價，噬菌體感染宿主菌的裂解量約為172 pfu/cell，即平均每個宿主菌被KP002裂解能產生約172個子代噬菌體。

圖5KP002的一步生長曲線

Fig.5One-step growth curve of KP002

2.4.3感染曲線由感染曲線可知(圖6)，當MOI=0.1和1時，KP002對宿主菌的生長有抑制作用。作用150 min后，可完全抑制宿主菌生長。

圖6KP002的感染曲線

Fig.6Infection curve of KP002

2.5噬菌體基因組的結構特點及基因功能預測

噬菌體KP002的基因組為環(huán)狀雙鏈DNA，全長47 173 bp, GC含量為48%。其基因組分析表明，預測編碼75個ORF，其中39個ORF編碼的蛋白為假定蛋白，未發(fā)現(xiàn)tRNA序列。以KP002的全基因組序列通過BlastN與GenBank進行比對，結果表明KP002基因組與JD001有67%的序列相似(一致性≥93%)。其中>500 bp的相似片段見圖7，但與已報道的肺炎克雷伯菌噬菌體KP15、KP32、KP34和phiKO2的基因組序列差異較大[4]。

A:The diagram of circular genome of KP002. B: The diagram of circular genome of JD001. Numbers inside the rings show the size of phage genome and the numbers on the rings indicate the sequence position. Similar sequences (≥93%) of two genomes are shadowed with the same colour.

圖7KP002與JD001環(huán)狀基因組比較示意圖

Fig.7Comparison of circular genomes of KP002 and JD001

比對分析KP002與JD001的基因組編碼信息發(fā)現(xiàn)，KP002編碼的75個ORF中，46個ORF與JD001 ORF相似，其中29個為KP002特有編碼基因。KP002基因組共編碼2個溶菌酶基因，均與JD001的2個編碼基因相似。在29個特異編碼基因中，24個為未知功能基因，4個已知功能的基因分別編碼噬菌體相關的核酸內切酶(HNH endonuclease family protein)、DNA結合蛋白、DNA聚合酶、DNA解螺旋酶。

3討論

肺炎克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌。其主要耐藥機制是產ESBL，近年來產碳青霉烯酶的菌株也不斷增多[5]。對肺炎克雷伯菌引起的威脅生命的感染，碳青霉烯類抗生素是最后的治療手段。但根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的首份全球抗生素耐藥監(jiān)測報告，肺炎克雷伯菌對第3代頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素的耐藥性已傳播到全世界[6]。在某些國家，碳青霉烯類抗生素對50%以上肺炎克雷伯菌感染患者無效。近年來，抗生素濫用導致細菌耐藥性劇增，肺炎克雷伯菌日益嚴重的耐藥問題給臨床治療帶來了困難[7]。

針對耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌感染的治療，有學者提出抗生素聯(lián)合療法。聯(lián)合治療在提高療效方面效果顯著，但由于藥物協(xié)同作用，其缺點如不良反應增加也非常明顯。目前，大多數(shù)針對耐藥肺炎克雷伯菌的聯(lián)合療法沒有循證醫(yī)學支持[8]。因此，在抗生素治療失敗的情況下尋找替代療法迫在眉睫，而噬菌體療法的可操作性也得到了廣泛認可。與抗生素相比，噬菌體能對感染細菌產生特異性殺傷作用而不影響正常菌群組成[9]。噬菌體及其混合物能阻止耐藥細菌生物膜的形成，有助于生物膜清除而達到抗菌目的，同時噬菌體雞尾酒療法可防止噬菌體耐藥性的發(fā)展[10]。雖然我國尚未開展噬菌體治療方面的臨床試驗，但早在20世紀西方國家陸續(xù)開展了一些臨床試驗研究[11]。孟加拉國和瑞士的合作研究發(fā)現(xiàn)，口服大腸埃希菌噬菌體的志愿者未發(fā)現(xiàn)有肝臟、腎臟和血液毒性，也未對腸道正常菌群有影響[12]。英國已開展用銅綠假單胞菌噬菌體制劑來治療耐藥銅綠假單胞菌感染所致慢性中耳炎的臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究。在比利時布魯塞爾，研究人員將銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的雞尾酒制劑用于燒傷患者的臨床試驗，并成功治愈了燒傷感染[13]。澳大利亞研究者與格魯吉亞研究者合作，成功應用噬菌體制劑控制了抗生素治療失敗的尿路細菌感染[14]。這些研究結果均表明，噬菌體具有潛在的應用價值。

本研究以80株肺炎克雷伯菌臨床耐藥株為宿主菌，從污水樣本中分離獲得1株針對耐藥肺炎克雷伯菌的烈性噬菌體，命名為KP002，其屬于有尾噬菌體。對其生物學特性進行研究及分析后發(fā)現(xiàn)，KP002具有較高的酸堿穩(wěn)定性，pH適應范圍較寬，在中性環(huán)境下穩(wěn)定性高，對堿性環(huán)境的耐受性強于對酸性環(huán)境的耐受性；其對溫度的耐受性也較高。噬菌體如果用于臨床治療，要求其不僅能在體內溫度和pH條件下保持高活性，還要在制成醫(yī)療制品時不易失活[15]。KP002對溫度及酸堿性均具有較好的穩(wěn)定性，具有成為噬菌體儲備庫的潛能。

KP002針對宿主菌的吸附速度快，6 min 95%以上噬菌體吸附至細菌表面，這一特性使其能更快、更多地裂解細菌。KP002裂解期短，可見其感染宿主菌的周期短，因此裂解速度快。KP002的裂解量約為172 pfu/cell，平均每個宿主菌被裂解能產生約172個子代噬菌體，體現(xiàn)了其裂解能力較強的特點。這些生物學特性使KP002應用于醫(yī)療制品成為可能。

KP002 基因組與已報道的噬菌體KP15、KP32、KP34和phiKO2基因組基本不具有相似性，與JD001的相似性為67%，且編碼相同的2個噬菌體裂解酶或溶菌酶，表明可能具有相同的起源；但該溶菌酶與已報道的其他噬菌體裂解酶相似性低，親緣性小，具有較大的研究價值[16]。與JD001不同的是，KP002編碼一些特異的噬菌體相關核酸內切酶、DNA結合蛋白、DNA聚合酶及DNA解螺旋酶，可能與KP002和JD001對宿主的不同適應特征有關。對這些特定結構域的基因功能進行研究，可為噬菌體用于臨床治療多重耐藥菌感染提供新的研究思路[17]，也為今后的流行病學、噬菌體基因組學、噬菌體工程改造和噬菌體治療等研究提供基本數(shù)據(jù)和一定幫助[18]。

參考文獻

[1]Tzouvelekis LS, Markogiannakis A, Piperaki E, Souli M, Daikos GL. Treating infections caused by carbapenemase-producing Enterobacteriaceae [J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20(9): 862-872.

[2]T?ngdén T, Giske CG. Global dissemination of extensively drug-resistant carbapenemase-producing Enterobacteriaceae: clinical perspectives on detection, treatment and infection control [J]. J Intern Med, 2015, 277(5): 501-512.

[3]Hung CH, Kuo CF, Wang CH, Wu CM, Tsao N. Experimental phage therapy in treating Klebsiella pneumoniae-mediated liver abscesses and bacteremia in mice [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(4): 1358-1365.

[4]Drulis-Kawa Z, Mackiewicz P, Kesik-Szeloch A, Maciaszczyk-Dziubinska E, Weber-Dabrowska B, Dorotkiewicz-Jach A, Augustyniak D, Majkowska-Skrobek G, Bocer T, Empel J, Kropinski AM. Isolation and characterisation of KP34——a novel φKMV-like bacteriophage for Klebsiella pneumoniae [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 90(4): 1333-1345.

[5]Hirsch EB, Tam VH. Detection and treatment options for Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPCs): an emerging cause of multidrug-resistant infection [J]. J Antimicrob Chemother, 2010, 65(6): 1119-1125.

[6]Kumarasamy KK, Toleman MA, Walsh TR, Bagaria J, Butt F, Balakrishnan R, Chaudhary U, Doumith M, Giske CG, Irfan S, Krishnan P, Kumar AV, Maharjan S, Mushtaq S, Noorie T, Paterson DL, Pearson A, Perry C, Pike R, Rao B, Ray U, Sarma JB, Sharma M, Sheridan E, Thirunarayan MA, Turton J, Upadhyay S, Warner M, Welfare W, Livermore DM, Woodford N. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study [J]. Lancet Infect Dis, 2010, 10(9): 597-602.

[7]管婧，卓超，蘇丹虹，倪語星，孫景勇，汪復，朱德妹，胡付品，徐英春，張小江，俞云松，楊青，陳中舉，孫自鏞，張朝霞，季萍，單斌，杜艷，張泓，孔菁，徐元宏，沈繼錄，王傳清，王愛敏，胡志東，李全，魏蓮花，吳玲，胡云建，艾效曼.2012年中國CHINET克雷伯菌屬細菌耐藥性監(jiān)測 [J].中國感染與化療雜志，2014，14(5)：398-404.

[8]Paul M, Carmeli Y, Durante-Mangoni E, Mouton JW, Tacconelli E, Theuretzbacher U, Mussini C, Leibovici L. Combination therapy for carbapenem-resistant Gram-negative bacteria [J]. J Antimicrob Chemother, 2014, 69(9): 2305-2309.

[9]Verma V, Harjai K, Chhibber S. Structural changes induced by a lytic bacteriophage make ciprofloxacin effective against older biofilm of Klebsiella pneumoniae [J]. Biofouling, 2010, 26(6): 729-737.

[10]Parasion S, Kwiatek M, Gryko R, Mizak L, Malm A. Bacteriophages as an alternative strategy for fighting biofilm development [J]. Pol J Microbiol, 2014, 63(2): 137-145.

[11]Abedon ST, Kuhl SJ, Blasdel BG, Kutter EM. Phage treatment of human infections [J]. Bacteriophage, 2011, 1(2): 66-85.

[12]Majewska J, Beta W, Lecion D, Hodyra-Stefaniak K, Kopot A, Kazmierczak Z, Miernikiewicz P, Piotrowicz A, Ciekot J, Owczarek B, Kopciuch A, Wojtyna K, Harhala M, Makosa M, Dabrowska K. Oral application of T4 phage induces weak antibody production in the gut and in the blood [J]. Viruses, 2015, 7(8): 4783-4799.

[13]Hawkins C, Harper D, Burch D, Angg?rd E, Soothill J. Topical treatment of Pseudomonas aeruginosa otitis of dogs with a bacteriophage mixture: a before/after clinical trial [J]. Vet Microbiol, 2010, 146(3/4): 309-313.

[14]Khawaldeh A, Morales S, Dillon B, Alavidze Z, Ginn AN, Thomas L, Chapman SJ, Dublanchet A, Smithyman A, Iredell JR. Bacteriophage therapy for refractory Pseudomonas aeruginosa urinary tract infection [J]. J Med Microbiol, 2011, 60(Pt 11): 1697-1700.

[15]Kumari S, Harjai K, Chhibber S. Efficacy of bacteriophage treatment in murine burn wound infection induced by Klebsiella pneumoniae [J]. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(6): 622-628.

[16]Kesik-Szeloch A, Drulis-Kawa Z, Weber-Dabrowska B, Kassner J, Majkowska-Skrobek G, Augustyniak D, Lusiak-Szelachowska M, Zaczek M, Górski A, Kropinski AM. Characterising the biology of novel lytic bacteriophages infecting multidrug resistant Klebsiella pneumoniae [J]. Virol J, 2013, 10: 100.

[17]Verma V, Harjai K, Chhibber S. Characterization of a T7-like lytic bacteriophage of Klebsiella pneumoniae B5055: a potential therapeutic agent [J]. Curr Microbiol, 2009, 59(3): 274-281.

[18]Cui Z, Shen W, Wang Z, Zhang H, Me R, Wang Y, Zeng L, Zhu Y, Qin J, He P, Guo X. Complete genome sequence of Klebsiella pneumoniae phage JD001 [J]. J Virol, 2012, 86(24): 13843.

Corresponding author. QIN Jinhong, E-mail: jinhongqin@sjtu.edu.cn

·論著·

Biological characterization and genome sequence of KP002, a novel bacteriophage isolated from multiple-drug resistantKlebsiellapneumonia

GAO Jing1,2, XU Bin3, GUO Xiaokui1, QIN Jinhong1

1. Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China; 2. Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China; 3. Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Chongming Branch, Shanghai 202150, China

Abstract:Multiple drug-resistantKlebsiellapneumoniastrains collected from several hospitals in Shanghai were used as the host bacteria to isolate phages in the wastewater. A novel phage KP002 was isolated and analyzed in details. The morphology and size of the bacteriophage was observed by electron microscope with negative staining. The results indicated that it was a tailed phage with head diameter about 70 nm, tail length about 80 nm and tail width about 20 nm. This phage had high activity at pH from 3 to 9 and temperature from 4 to 50 ℃. The adsorption rate was above 95% within 6 min. Its incubation period was 10 min and burst period was 50 min. The burst size reached 172 pfu/cell. The whole genome sequence showed that it contained a circular double-stranded DNA with a full-length of 47 173 bp and GC content of 48%. KP002 is a new phage against drug-resistant bacteria and could be served as a potential resource for clinical treatment of multiple-drug resistant bacterial infection.

Key words:Multiple drug-resistantKlebsiellapneumonia; Bacteriophage; Genomics

收稿日期：(2015-08-18)

通信作者：秦金紅

基金項目：國家科技支撐計劃(2012EP001004)