高航，單雪玉，高延芬，徐虹，*

(1．北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心/北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048;2．深圳市航天食品分析測試中心有限公司，廣東深圳 518040)

蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

高航1，單雪玉1，高延芬2，徐虹1，*

(1．北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心/北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048;2．深圳市航天食品分析測試中心有限公司，廣東深圳 518040)

采用分光光度法測定了不同條件下蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響，在單因素實驗基礎上運用L9(34)正交法得到蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的優(yōu)化條件。研究結果顯示，在pH值為6．8，質量濃度為1．50 g/L，反應時間為20 min時，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率最高，可達67．99%±1．79%。蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為反競爭性抑制，抑制常數(shù)為0．24 g/L。

蓮子紅衣多酚;α-葡萄糖苷酶;活性抑制;抑制類型

研究發(fā)現(xiàn)，降低餐后血糖可有效控制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)展［1］。α-葡萄糖苷酶是小腸絨毛上皮細胞刷狀緣膜上存在的寡糖水解酶，可催化α-1，4糖苷鍵水解。α-葡萄糖苷酶可將碳水化合物分解為葡萄糖，因此抑制α-葡萄糖苷酶活性，并可延緩及阻礙葡萄糖的生成及吸收，降低餐后血糖峰值，達到控制及預防糖尿病的效果［2］。眾多研究已表明，植物多酚對α-葡萄糖苷酶具有很強的抑制作用，并且具有來源廣泛、毒副作用小等特點。目前，植物源α-葡萄糖苷酶抑制劑的篩選已經(jīng)成為天然產(chǎn)物研究領域的熱點［3-5］。

蓮子紅衣為蓮子殼與蓮子果實中間包裹的一層紅褐色種皮，《本草綱目》和《中華藥典》記載其味苦而澀、性涼無毒，入心、脾二經(jīng)，且具有清熱利濕、收斂，治濕熱瀉痢等作用［6］。在蓮子加工過程中，這層紅衣一般通過機械打磨去除，我國每年在白蓮加工過程中會產(chǎn)生約1萬t蓮子紅衣粉。目前這些加工副產(chǎn)物尚無有效利用方式，且因其味澀甚至不能作為牲畜飼料，因而常被大量廢棄并造成環(huán)境污染。本課題組前期研究已經(jīng)對蓮子紅衣中的活性成分進行了初步探索，其中活性多酚類物質含量較高，且具有顯著的抗氧化和抗蘋果褐變活性［7-8］。為更好地開發(fā)利用蓮子工業(yè)加工中的副產(chǎn)物，本研究從蓮子紅衣粉中提取獲得其中的多酚物質，探討其對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。希望本研究成果能夠為糖尿病人群功能食品的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子紅衣粉，三湘貿(mào)易公司;α-葡萄糖苷酶(BR)，上海源葉生物科技有限公司;4-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(pNPG)、4-硝基苯酚(PNP)，美國Sigma公司;Na2CO3、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3(均為化學純)，國藥集團化學試劑有限公司;沒食子酸(分析純)，天津市光復科技發(fā)展有限公司;福林酚(化學純)，北京普博欣生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

JA2003C型電子天平，上海越平科學儀器有限公司;FE20型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-501型超級恒溫水浴(數(shù)顯)，常州國華電器有限公司;DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精密實驗設備有限公司; 22PCO2435型可見分光光度計、SpectrumLab 53型紫外-可見分光光度計，上海棱光技術有限公司;QL -901 VORTEX型漩渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;MODULYOD-230型真空冷凍干燥機，美國熱電公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蓮子紅衣多酚的提取

蓮子紅衣(日照曬干，含水量為8．5%)粉碎過篩至80目，按料(g)液(L)比1∶1．8加入體積分數(shù)為60%的乙醇，在49℃下300 W微波提取9．5 min，提取液10000 r/min離心10 min，上清液旋蒸后真空冷凍干燥，4℃保存，備用。

1.3.2 蓮子紅衣多酚的質譜分析

采用Thermo的TSQ質譜定量分析蓮子紅衣多酚可能含有的多酚類物質。通過與蘆丁、表兒茶素等8種標準品進行比對，根據(jù)出峰情況來確定蓮子紅衣多酚中各種標品的含量。色譜柱，C18(30 mm ×3．0 mm);進樣量7 μL，流速200 μL/min;流動相A，0．1%甲酸-氰化氫;流動相B，0．1%甲酸-水，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫蓮子紅衣多酚成分的條件Tab．1Gradient elution for determination of compounds

1.3.3 蓮子紅衣多酚提取物含量的測定

1)標準曲線的建立［9］。準確稱取沒食子酸0．10 g，蒸餾水溶解并定容至100 mL，分別移取0，20，40，60，80，100，120 μL到7個具塞試管中并用蒸餾水定容至1 mL，即得到不同質量濃度的沒食子酸標準溶液;分別加入2 mL質量濃度為20 g/L的 Na2CO3，2 min后，將1 mL的福林酚試劑(按體積比1∶1與水稀釋)加入到混合物中，反應30 min后在750 nm波長處測定吸光度;以沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

2)樣品測定。加入適當質量濃度樣品，具體步驟同上，通過回歸方程得出等價沒食子酸含量。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶活力的測定［10］

α-葡萄糖苷酶活力單位定義:37℃，在pH值為6．8條件下，每分鐘水解底物釋放1．0 μmol對硝基苯酚規(guī)定為一個酶活力單位(U)。

蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率計算公式，見式(1)。

1.3.5 反應時間對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響實驗

將α-葡萄糖苷酶溶液與600 μL蓮子紅衣多酚溶液混勻后在37℃預熱5 min，加入200 μL、pNPG啟動反應，分別在10，15，20，25，30 min時終止反應，測定不同時間剩余酶活力，計算抑制率。

1.3.6 蓮子紅衣多酚濃度對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響實驗

在pH值為6．8時，將α-葡萄糖苷酶溶液分別與質量濃度為0．10，0．50，1．00，1．50，2．00 g/L的蓮子紅衣多酚溶液混勻，并在37℃預熱5 min，加入pNPG啟動反應。20 min后終止反應，測定加入不同濃度多酚溶液后的酶活力，并計算抑制率。

1.3.7 緩沖液pH值對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響實驗

以pH值為6．4，6．6，6．8，7．0，7．2的緩沖液為溶劑，分別配制1．0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和1．0 mmol/L pNPG底物溶液。將1．0 U/mL α-葡萄糖苷酶600 μL與1．00 g/L蓮子紅衣多酚溶液600 μL混勻，于37℃水浴中預熱5 min，加入1．0 mmol/L pNPG 200 μL，20 min后終止反應，測定不同pH值緩沖液條件下的酶活力，計算抑制率。

1.3.8 蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶活力的條件優(yōu)化實驗

為了綜合考慮各因素對α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響，綜合單因素實驗結果，選擇反應時間(A)、抑制劑質量濃度(B)、pH值(C)三個因素，采用L9(34)正交試驗法對抑制α-葡萄糖苷酶活性的條件進行優(yōu)化，正交試驗因素水平，見表2。1.3.9抑制作用類型的測定

表2 正交試驗因素水平Tab．2Factors and levels of orthogonal experiments

將α-葡萄糖苷酶分別與質量濃度為1．00，1．50，2．00 g/L的蓮子紅衣多酚混勻，預熱5 min后加入不同濃度的pNPG溶液反應20 min，加入0．5 mol/L Na2CO31．0 mL。以底物質量濃度的倒數(shù)1/［S］為橫坐標，反應速度的倒數(shù)1/v為縱坐標，繪制蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶抑制作用的雙倒數(shù)圖，根據(jù)雙倒數(shù)方程計算其抑制常數(shù)Ki。

2 結果與分析

2.1 蓮子紅衣多酚中成分及含量分析

蓮子紅衣多酚組成和含量分析結果見表3。據(jù)表3可知，蓮子紅衣多酚中兒茶素的質量分數(shù)最高，占28．05%，表兒茶素和沒食子酸次之，分別為23．24%和16．36%。根皮苷、蘆丁、阿魏酸、槲皮素和咖啡酸的含量都較少，且依次減少。根據(jù)標準曲線的制作方法，得回歸方程，見式(2)。

通過回歸方程得出每克蓮子紅衣提取物中多酚質量為(237．91±11．28)mg。

表3 蓮子紅衣多酚組成和含量分析結果Tab．3Content analysis results of lotus red polyphenol %

2.2 反應時間對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響

按照1.3.5方法，在酶與底物反應時間分別為10，15，20，25，30 min時終止反應，計算蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，變化趨勢如圖1。

圖1 反應時間與α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的關系Fig．1Effect of different reaction time on activity of α-glucosidase

從圖1可以看出，在反應時間小于20 min時，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制效果不佳，抑制率較低。隨著反應時間的延長，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且在加入底物反應20 min時，抑制率達到最大。

2.3 蓮子紅衣多酚質量濃度對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響

按照1.3.6方法，將質量濃度分別為0．10，0．50，1．00，1．50，2．00 g/L的蓮子紅衣多酚溶液加入到反應體系當中，終止反應后計算蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，結果見圖2。

圖2 蓮子紅衣多酚質量濃度與α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的關系Fig．2Effect of lotus seed skin concentrations on activity of α-glucosidase

圖2顯示，蓮子紅衣多酚在較低濃度范圍內(nèi)即可達到較高的抑制效果。蓮子紅衣多酚質量濃度為1．00 g/L時，抑制作用接近70%。然而并非多酚質量濃度越大，抑制效果越好，當多酚質量濃度在2．00 g/L時，抑制率迅速下降，很可能是多酚達到一定濃度后會改變酶的構象。

2.4 緩沖液pH值對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的影響

按照1.3.7方法，在pH值為6．6，6．8，7．0，7．2的緩沖液體系中啟動反應，計算蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，變化曲線見圖3。

圖3 緩沖液pH值與α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的關系Fig．3Effect of pH on activity of α-glucosidase

由圖3可見，在實驗范圍內(nèi)(pH值為7．0～7．8)，α-葡萄糖苷酶抑制率先隨pH值增加而迅速升高，隨后隨著pH值增加而逐漸下降。在pH值為6．8時，α-葡萄糖苷酶的抑制率達到最高。

2.5 蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶活力的條件優(yōu)化

采用正交試驗法對蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性作用進行優(yōu)化，結果見表4。

表4 正交試驗結果Tab．4Results of orthogonal design

表4中，通過K值大小可得出各因素對抑制α-葡萄糖苷酶活性的影響效果，從大到小順序為:反應時間、pH值、抑制劑質量濃度。綜合分析結果可知，抑制效果較佳時反應條件為A2B3C2，即在pH值為6．8條件下，使用抑制劑質量濃度為1．50 g/L，反應時間為20 min時，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制率可達到最高。

2.6 驗證實驗結果分析

按照A2B2C3的條件進行驗證實驗，結果顯示，A2B2C3的抑制率為67．99%±1．70%。因此，最終確定優(yōu)化反應條件為pH值6．8，抑制劑質量濃度1．50 g/L，反應時間為20 min。

2.7 抑制作用類型的確定

按照1.3.9方法，測定不同條件下的酶活力，采用雙倒數(shù)作圖法，求解抑制常數(shù)并確定抑制類型，結果見圖4。

圖4 蓮子紅衣多酚抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線Fig．4Lineweaver-Burk figure of polyphenols from lotus seed skin on α-glucosidase

從圖4可以看出，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用與其質量濃度存在劑量-效應關系。隨著蓮子紅衣多酚質量濃度的增大，其對α-葡萄糖苷酶抑制作用逐漸增強。α-葡萄糖苷酶動力學曲線vmax值變小，Km值也變小，而vmax/Km值不變。這表明了蓮子紅衣多酚是α-葡萄糖苷酶的反競爭性抑制劑，即抑制劑只與酶-底物復合物結合，而不與游離酶結合。當蓮子紅衣多酚質量濃度為1．00 g/L時，其對α-葡萄糖苷酶的抑制常數(shù)Ki為0．24 g/L。

3 討論與結論

我國為產(chǎn)蓮大國，蓮子在加工過程中打磨出的大量紅衣粉，目前僅被作為廢棄物浪費，至今沒有得到很好應用。研究發(fā)現(xiàn)，這些廢棄物中不乏豐富的營養(yǎng)物質和活性成分［8］，若能從中分離獲得有效的功能性成分并在保健食品中得以應用，將會大大提高蓮子紅衣副產(chǎn)物的利用率，并有助于提升蓮子的綜合利用價值和經(jīng)濟價值，同時希望為新資源的開發(fā)利用提供更多的理論依據(jù)。

大量研究顯示，多種植物中所含的多酚類物質具有α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用，從而延緩人體對食物中葡萄糖的吸收，降低餐后血糖。比較近年來多篇研究報道，可知不同植物源α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制作用差別很大，如石榴花多酚對體外α-葡萄糖苷酶的抑制率可達90．79%［11］，而溪黃草多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率為44．15%［12］。本研究結果顯示，蓮子紅衣多酚對體外α-葡萄糖苷酶的抑制率可達67．99%±1．79%，其抑制類型為反競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki為0．24 g/L。從目前研究來看，酚類提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型包括非競爭性抑制、競爭性抑制和反競爭性抑制，這可能與其主要抑制酶活性成分的組成與結構以及與酶活性中心的結合部位和結合方式等的不同有關［13-14］。后期我們將進一步對蓮子紅衣多酚進行分級分離，以期更深入研究各多酚組分與α-葡萄糖苷酶之間的構效關系。此外，我們還將進行動物實驗，從體內(nèi)到體外綜合評價蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制機制，發(fā)揮其輔助治療糖尿病的功效。

綜上所述，不良飲食是導致糖尿病的主要原因之一，如能有效控制體內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性，便可減少食物中糖類物質的消化吸收，達到預防和治療糖尿病的效果。從本研究結果可知，蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制效果顯著，且原料資源豐富、價格極其低廉，具有良好的開發(fā)和應用前景。

［1］張潔．老年糖尿病患者餐后低血壓發(fā)生機制及藥物干預的研究［D］．北京:北京協(xié)和醫(yī)學院，2014．

［2］LEE S H，KANG S M，KO S C，et al．Octaphlorethol A: a potent α-glucosidase inhibitor isolated from Ishige foliacea shows an anti-hyperglycemic effect in mice with streptozotocin-induced diabetes［J］．Food and Function，2014，5(10):2602-2608．

［3］KANG S J，PARK J H Y，CHOI H N，et al．α-Glucosidase inhibitory activities of myricetin in animal models of diabetes mellitus［J］．Food Science and Biotechnology，2015，24(5):1897-1900．

［4］GONDI M，PRASADA RAO U J S．Ethanol extract of mango(Mangifera indica L．)peel inhibits α-amylase and α-glucosidase activities，and ameliorates diabetes related biochemical parameters in streptozotocin(STZ)-induced diabetic rats［J］．Journal of Food Science and Technology，2015，52(12):7883-7893．

［5］DONG H Q，LI M，ZHU F，et al．Inhibitory potential of trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd against αglucosidase and α-amylase linked to type 2 diabetes［J］．Food Chemistry，2012，130(2):261-266．

［6］鄭寶東，鄭金貴，曾紹校．我國主要蓮子品種中三種功效成分的研究［J］．營養(yǎng)學報，2004，26(2):158-160．

ZHENG B D，ZHENG J G，ZENG S J．Study on three functional components of Chinese main lotus seed varieties［J］．Acta Nutrimenta Sinica，2004，26(2):158-160．

［7］高航，高延芬，徐虹．蓮子紅衣醇提物的抗氧化和抗褐變活性［J］．食品科學，2013，34(11):83-87．

GAO H，GAO Y F，XU H．Antioxidant and anti-browning activities of ethanol extract from lotus seed skin［J］．Food Science，2013，34(11):83-87．

［8］徐虹，朱雨薇，曹楊，等．蓮子紅皮多糖提取工藝研究［J］．食品工業(yè)科技，2011，33(2):266-268．

XU H，ZHU Y W，CAO Y，et al．Study on extraction technology of polysaccharides from red skin of locus seed［J］．Science and Technology of Food Industry，2011，33 (2):266-268．

［9］朱彩平，夏德水．Folin-Ciocalteu比色法測定石榴皮提取物中的多酚［J］．光譜實驗室，2012，29(3):1356-1360．

ZHU C P，XIA D S．Determination of polyphenols in pomegranate peel extracts by Folin-Ciocalteu colorimetry［J］．Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2012，29 (3):1356-1360．

［10］張蓉，劉利娥，楊衛(wèi)紅．芝麻葉多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究［J］．醫(yī)藥論壇雜志，2014，35(1): 69-72．

ZHANG R，LIU L E，YANG W H．Inhibitory effect of total on alpha-glucosidase polyphenols from sesame leaf［J］．Journal of Medical Forum，2014，35(1):69-72．

［11］阿依仙木·加帕爾，閆冬，何雯，等．維藥石榴花多酚提取物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用的研究［J］．新疆醫(yī)科大學學報，2013，36(5):581-583．

AYXAN·Jappar，YAN D，HE W，et al．Inhibitory effects of pomegranate polyphenol extracts on α-glucosidase and α-amylase［J］．Journal of Xinjiang Medical University，2013，36(5):581-583．

［12］費群勤，秦一禾，楊孟伽，等．烏龍茶粗多酚、EGCG和EGCG3″Me體外抑α-葡萄糖苷酶活性［J］．食品科學，2014，35(21):10-15．

FEI Q Q，QIN Y H，YANG M G，et al．In vitro inhibitory effects of oolong tea polyphenols，EGCG and EGCG3"me on α-glucosidase activity［J］．Food Science，2014，35(21):10-15．

［13］林戀竹．溪黃草有效成分分離純化、結構鑒定及活性評價［D］．廣州:華南理工大學，2013．

［14］KANG Wenyi，ZHANG Li．α-Glucosidase inhibitory activity of extracts of five genera of gesneriaceae［J］．Natural Product Research and Development，2010，22:122 -125．

Inhibitory Effect on α-Glucosidase Activity of Polyphenol from Red-skin of Lotus Seed

GAO Hang1，SHAN Xueyu1，GAO Yanfen2，XU Hong1，*
(1．Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China; 2．Shenzhen Space Food Analysis and Test Center Limited Company，Shenzhen 518040，China)

The aim of the research was to discuss the inhibitory effect of polyphenol from lotus seed redskin on α-glucosidase activity．It was designed to measure the α-glucosidase activity in different conditions using spectrophotometry．With the inhibitory effect on α-glucosidase activity as the index，the inhibitory conditions were optimized by the L9(34)orthogonal optimization method．The results revealed that the optimal inhibition rate was 67．99%±1．79%at pH 6．8，1．50 g/L of polyphenol concentration and 20 min of reaction time．In addition，polyphenol was an anti-competitive inhibition type of inhibitor on αglucosidase，and its inhibition constant was 0．24 g/L．

polyphenol from lotus seed red-skin;α-glucosidase;activity inhibition;inhibitor type

葉紅波)

TS201．2

A

10．3969/j．issn．2095-6002．2016．06． 007

2095-6002(2016)06-0036- 05

2016-03- 01

北京市自然科學基金資助項目(6162003);北京市屬高等學校創(chuàng)新團隊建設與教師職業(yè)發(fā)展計劃項目(IDHT20130506)。

高航，女，碩士研究生，研究方向為功能性食品;

*徐虹，女，副教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)與安全方面的研究。

。

高航，單雪玉，高延芬，等．蓮子紅衣多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用［J］．食品科學技術學報，2016，34(6):36-40．

GAO Hang，SHAN Xueyu，GAO Yanfen，et al．Inhibitory effect on α-glucosidase activity of polyphenol from red-skin of lotus seed［J］．Journal of Food Science and Technology，2016，34(6):36-40．