杜凡

·實(shí)驗(yàn)研究·

大鼠慢性脊髓損傷模型的建立

杜凡

目的探尋簡(jiǎn)便易行的慢性脊髓損傷模型建立方法,為探索脊髓型頸椎病的損傷機(jī)制、病理及進(jìn)一步為治療奠定基礎(chǔ)。方法56只成年wistar雌性大鼠,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,各28只。根據(jù)大鼠脊柱解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)自行設(shè)計(jì)一種大鼠脊髓壓迫復(fù)合體,用以制作大鼠慢性壓迫模型。運(yùn)用行為學(xué)、病理組織觀察等方法評(píng)價(jià)模型的可靠性。結(jié)果脊髓壓迫后兩組大鼠行為學(xué)評(píng)分(BBB)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；觀察兩組病理切片,可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組明顯出現(xiàn)尼氏體減少,細(xì)胞核崩解,神經(jīng)元壞死、減少,泡沫細(xì)胞形成,神經(jīng)纖維脫髓鞘。結(jié)論本方法提供了一種理想的制作鼠慢性脊髓壓迫損傷方法。

脊髓損傷；動(dòng)物模型；大鼠；病理

完全復(fù)制人的慢性脊髓壓迫損傷的動(dòng)物模型,一直以來(lái)是脊髓損傷的理想目標(biāo),之前有很多人為之而努力,發(fā)明了很多慢性脊髓壓迫損傷動(dòng)物模型的制作方法,比較常用的有脊髓后路植入螺釘［1］、椎管內(nèi)植入氣囊［2］、膨脹物壓迫［3］、腫瘤壓迫［4］等,本實(shí)驗(yàn)采用膨脹物壓迫法?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料 2013年取56只260～280 g成年wistar雌性大鼠(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供),隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組28只。

1.2動(dòng)物模型的制作方法 采用異戊巴比妥10 g/L(40 mg/kg)腹腔麻醉,備皮、消毒、常規(guī)消毒鋪巾,后正中切口,暴露T6～9椎板,咬除T7、8椎板,見(jiàn)硬脊膜,將粘于鋼片下的壓迫物置于已暴露硬脊膜的脊髓節(jié)段上,并用穿過(guò)雙側(cè)肋骨的手術(shù)線將壓迫物牢固的固定在脊柱上,后逐層縫合傷口,每組取4個(gè)時(shí)間點(diǎn)：2、3、4、6周,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)7只；對(duì)照組將膨脹物粘于鋼片的背側(cè)后,固定于T7、8節(jié)段,即不對(duì)脊髓有任何壓迫。術(shù)后抗炎1周。

1.3壓迫物的制作 10只wistar大鼠進(jìn)行解剖,根據(jù)大鼠T7、8脊髓節(jié)段脊椎的平均寬度、雙側(cè)椎板的角度制作壓迫物的幾何形狀,壓迫物由兩部分組成,分別為7.0 mm×7.2 mm ×0.8 mm的不銹鋼鋼片和5.0 mm×1.5 mm×1.0 mm的膨脹物(主要成分為緩慢膨脹型橡膠)組成,其中鋼片是由線切割機(jī)(由東北大學(xué)實(shí)習(xí)工廠提供)切割而成,每個(gè)均為誤差在0.2 mm內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)幾何形狀,將其中線處折彎,折彎角度為100°,誤差范圍在1°；膨脹物主要成分是橡膠的復(fù)合材料,經(jīng)流化為要求的標(biāo)準(zhǔn)尺寸后,將膨脹物粘于鋼片內(nèi)側(cè),形成一牢固的壓迫物。

1.4行為學(xué)評(píng)分 術(shù)后分別對(duì)2、3、4、6周進(jìn)行大鼠的行為學(xué)觀察,參照BBB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［2］,采取雙盲、雙人獨(dú)立觀察記錄,記錄后的結(jié)果取均值。

1.5病理觀察 將處于時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)物腹腔麻醉后,分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%的多聚甲醛心臟灌注,待灌流液為無(wú)色為止,小心取出完整壓迫段脊髓,再用多聚甲醛侵泡24 h后,常規(guī)脫水,透明,侵蠟,石蠟包埋,切片,普通蘇木精-伊紅染色法(HE)染色,置于光鏡下觀察脊髓組織結(jié)構(gòu)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較 大鼠在術(shù)后6 h后完全蘇醒,所有的術(shù)后大鼠都活動(dòng)自如,無(wú)跖肌步態(tài),前后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng),可以支持體重,約術(shù)后第4天時(shí)大部分動(dòng)物逐漸出現(xiàn)走路協(xié)調(diào)性差,跖肌步態(tài),后肢不能完全支撐體重,尾巴下垂,后爪前進(jìn)時(shí)不與身體方向一致,即內(nèi)旋或外旋表現(xiàn),至7～10 d時(shí),動(dòng)物均出現(xiàn)后肢的完全性癱,動(dòng)物肌張力減退、輕度活動(dòng)甚至無(wú)運(yùn)動(dòng)、不能支撐體重,尿便均正常,隨著時(shí)間延長(zhǎng)(2～4周)動(dòng)物的癥狀會(huì)有自我恢復(fù)的現(xiàn)象,即出現(xiàn)近端肌肉肌力部分恢復(fù),由全癱轉(zhuǎn)為不全癱,4周后動(dòng)物行為學(xué)癥狀趨于穩(wěn)定。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組BBB評(píng)分比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠慢性脊髓損傷后BBB評(píng)分比較(±s,分)

表1 兩組大鼠慢性脊髓損傷后BBB評(píng)分比較(±s,分)

注：兩組比較,P＜0.05

組別 只數(shù) 2 周 3 周 4 周 6 周對(duì)照組 28 8.45±0.95 10.36±0.65 15.47±0.35 18.24±0.28實(shí)驗(yàn)組 28 4.8±0.68 8.75±1.03 10.67±1.06 11.20±0.78

2.2兩組大鼠組織病理學(xué)檢查 大體觀察,大鼠脊髓組織均有不同程度的壓痕,硬脊膜完整,無(wú)明顯顏色改變,切開(kāi)硬膜后,可見(jiàn)脊髓在矢狀徑上,有不同程度的變扁,組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯紊亂,灰質(zhì)、白質(zhì)境界仍可分辨,HE染色光鏡下觀察,脊髓形態(tài)不完整,神經(jīng)組織殘缺;灰質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯減少;灰質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)尼氏小體崩解、減少至完全消失,細(xì)胞核裂解甚至消失、細(xì)胞腫脹；細(xì)胞膜溶解破損、邊界不清；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,泡沫細(xì)胞形成；呈衛(wèi)星狀圍繞變性的神經(jīng)細(xì)胞,并變性為格子細(xì)胞;膠質(zhì)細(xì)胞增生圍繞壞死的神經(jīng)細(xì)胞呈噬節(jié)現(xiàn)象；室管膜細(xì)胞增生,向內(nèi)侵入中央管并成團(tuán)阻塞管腔,向外侵入灰質(zhì);白質(zhì)纖維分布不均勻,纖維減少,髓鞘排列紊亂,髓鞘間隙擴(kuò)大,脫髓鞘,形態(tài)不完整。見(jiàn)圖1～4。

圖1 實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元尼氏體減少、核溶解,胞漿著色變淺,胞體腫脹,細(xì)胞由多極形狀變?yōu)閳A形,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生(HE×400)

圖2、圖3 實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元減少、泡沫細(xì)胞形成,可見(jiàn)少許格子細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生(HE×400)

圖4 實(shí)驗(yàn)組髓鞘間隙擴(kuò)大,神經(jīng)纖維脫髓鞘(HE×400)

3 討論

3.1本模型的評(píng)價(jià) 一直以來(lái),許多學(xué)者用不同的方法探尋、制作慢性脊髓損傷動(dòng)物模型,但每種方法都有缺點(diǎn),仍需要尋找一種能準(zhǔn)確復(fù)制慢性脊髓損傷的動(dòng)物模型。1989年Arbit等［3］將直徑為0.25 mm的甲基纖維素-聚丙烯晴塊植入硬膜外,依賴其的膨脹特性產(chǎn)生對(duì)脊髓的機(jī)械壓迫作用。該方法對(duì)脊髓的壓迫作用較緩慢,與人慢性脊髓損傷的疾病過(guò)程比較相似。本實(shí)驗(yàn)亦采用該試驗(yàn)原理,對(duì)不足之處加以完善,①本實(shí)驗(yàn)壓迫物并不是放在椎板下,而是將椎板咬除后,將壓迫物復(fù)合體固定于背部,這樣可以避免手術(shù)操作時(shí)對(duì)動(dòng)物造成急性損傷的可能；②采用相對(duì)堅(jiān)硬的膨脹材料,這樣對(duì)脊髓的壓迫作用更確實(shí)；③由于鋼板的幾何形狀是可以調(diào)節(jié)的,這樣壓迫物的形狀大小就不受椎管內(nèi)狹小的空間限制,可采用最符合試驗(yàn)要求的尺寸壓迫,對(duì)膨脹物有更大的選擇范圍。本實(shí)驗(yàn)采取T7、8節(jié)段壓迫,一方面與BBB造模節(jié)段相一致,另一方面T7、8節(jié)段損傷對(duì)動(dòng)物的呼吸、循環(huán)及術(shù)后的二便功能損傷較小,易于長(zhǎng)期飼養(yǎng),以適合造慢性模型的需要。

3.2慢性壓迫模型的行為學(xué)、病理學(xué)評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)成功的復(fù)制了慢性脊髓損傷動(dòng)物模型,并對(duì)其進(jìn)行了行為學(xué)、病理學(xué)方面的評(píng)價(jià)。

3.2.1行為學(xué)評(píng)價(jià) BBB評(píng)分是觀察動(dòng)物的臀、膝、踝關(guān)節(jié)、行走、軀干運(yùn)動(dòng)及起協(xié)調(diào)情況［5］,該方法對(duì)動(dòng)物的行為學(xué)癥狀觀察的比較詳細(xì)、全面,與脊髓損傷的程度高度相符［6］。鑒于此,該方法被廣泛應(yīng)用于脊髓損傷動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn),動(dòng)物在術(shù)后活動(dòng)正常,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)動(dòng)物會(huì)逐漸出現(xiàn)在BBB評(píng)分中提及的跖肌步態(tài)(plantar step)、后爪在運(yùn)動(dòng)時(shí)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)、腳趾間隙的擴(kuò)大、髖膝踝的過(guò)度運(yùn)動(dòng)(extentive movement)、不穩(wěn)定軀干運(yùn)動(dòng)(trunk instability)、前后肢不協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)(FL-HL incoordination) 不能支持體重(no weight support)等行為學(xué)癥狀。動(dòng)物出現(xiàn)的癥狀有連續(xù)性,較好的模擬了脊髓慢性損傷行為變化的全過(guò)程,是一種重復(fù)性好慢性脊髓損傷模型,適用于進(jìn)一步探尋病因及治療的動(dòng)物模型。

3.2.2病理學(xué)評(píng)價(jià) 脊髓損傷后,除機(jī)械性性損傷外,在數(shù)小時(shí)及數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)復(fù)雜的繼發(fā)性損傷,神經(jīng)細(xì)胞壞死、調(diào)亡是脊髓損傷的病理變化重要組成部分,最終導(dǎo)致脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量的減少,另一個(gè)很明顯的變化是神經(jīng)纖維脫髓鞘,有實(shí)驗(yàn)表明,在灰質(zhì)壞死部分的邊緣與剩余脫髓鞘軸索之間存在一個(gè)長(zhǎng)纖維束的不完整的軸突區(qū)域,在這個(gè)區(qū)域有節(jié)段性的脫髓鞘現(xiàn)象［9,10］,本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)在每組都有不同程度的神經(jīng)細(xì)胞的壞死,以及隨之而來(lái)的神經(jīng)元的減少及白質(zhì)的脫髓鞘現(xiàn)象,說(shuō)明在慢性脊髓損傷過(guò)程中,神經(jīng)細(xì)胞的壞死是一個(gè)漸進(jìn)連續(xù)的過(guò)程,究竟神經(jīng)細(xì)胞的密度下降到什么程度時(shí)脊髓的功能無(wú)法恢復(fù),仍需進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)大部分動(dòng)物行為學(xué)評(píng)分與病理學(xué)檢測(cè)是相符合的,但亦有少部分動(dòng)物病理變化與行為學(xué)評(píng)分不相符合的情況發(fā)生。

綜上所述,用該種方法可以很好的復(fù)制慢性脊髓損傷病理發(fā)展過(guò)程,而且操作簡(jiǎn)便,對(duì)材料要求較低,易于制作成功,該方法制作的模型適合于進(jìn)一步應(yīng)用于脊髓型頸椎病的病因及治療的研究中。

［1］Hukuda S,Wilson CB.Experimental cervical myelopathy: effects of compression and ischemia on the canine cervical cord.Journal of Neurosurgery Publishing Group,1972,37(6):631-652.

［2］Lim JH,Jung CS,Byeon YE,et al.Erratum: Establishment of a canine spinal cord injury model induced by epidural balloon compression.Journal of Veterinary Science,2007,8(1):89-94.

［3］Arbit E,Galicich W ,Galicich JH,et al.An animal model of epidural compression of the spinal cord.Neurosurgery,1989,24(6):860-863.

［4］Yamazaki M,Moriya H,Goto S,et al.Increased type XI collagen expression in the spinal hyperostoic mouse (TWY/TWY).Calcified Tissue International,1991,48(3):182-189.

［5］Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.Journal of Neurotrauma,1995,12(1):1-21.

［6］王民,王棟琪,宋煥瑾.脊髓損傷后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)不同評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的比較.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,27(3):243-245.

［7］Simpson RK,Baskin DS.Corticomotor evoked potentials in acute and chronic blunt spinal cord injury in the rat: correlation with neurological outcome and histological damage.Neurosurgery,1987,20(1):131-137.

［8］Blight AR,Decrescito V.Morphometric analysis of experimental spinal cord injury in the cat: the relation of injury intensity to survival of myelinated axons.Neuroscience,1986,19(1):321-341.

［9］Salgadoceballos H,Guizarsahagun G,Feriavelasco A,et al.Spontaneous long-term remyelination after traumatic spinal cord injury in rats.Brain Research,1998,782(1-2):126-135.

Establishment of chronic rat spinal cord injury model

DU Fan.Department of Orthopaedics,Liaoning Shenyang City First People’s Hospital,Shenyang 110041,China

ObjectiveTo investigate easy and feasible establishment method of chronic rat spinal cord injury model,in order to lay the foundation of injury mechanism and pathology exploration in cervical spondylotic myelopathy and further treatment.MethodsA total of 56 adult female wistar rats were randomly divided into experimental group and control group,with 28 cases in each group.Rat spinal cord compression complexus was designed according to anatomical characteristics of rat spine,and the complexus was applied to establish model for chronic rate compression.Evaluation on reliability of the model was made by ethological and histopathological observation.ResultsAfter spinal cord compression,the difference of Basso Beattie and Bresnahan (BBB) locomotor rating scale had statistical significance between the two groups (P＜0.05).Observation on pathological section in the two groups showed obviously reduced Nissl substance,disintegrated cell nucleus,necrotic and reduced nerve cell,formation of foam cell and demyelination of nerve fiber in the experimental group.ConclusionThis method provides an ideal way in making chronic rat spinal cord injury model.

Spinal cord injury; Animal model; Rat; Pathology

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.06.216

2015-12-07］

110041 遼寧省沈陽(yáng)市第一人民院骨科