林海永，李世嘉，黃為福

(平南縣第二人民醫(yī)院腫瘤科，廣西 貴港 537307)

非小細胞肺癌組織中miR-219和環(huán)氧合酶-2表達水平聯(lián)合預(yù)測新輔助化療患者預(yù)后的價值

林海永，李世嘉，黃為福

(平南縣第二人民醫(yī)院腫瘤科，廣西 貴港 537307)

目的 探討非小細胞肺癌(NSCLC)組織中微小核糖核苷酸-219(miR-219)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)表達水平聯(lián)合預(yù)測新輔助化療患者預(yù)后的價值。方法采用免疫組化法檢測2009年1月至2012年1月期間我院應(yīng)用纖維支氣管鏡活檢所得的85例NSCLC組織(NSCLC組)、30例肺部良性病變組織(良性組)和30例正常肺組織（正常組)中miR-219和COX-2蛋白的表達水平。統(tǒng)計NSCLC組患者無疾病進展生存期(3年生存率)，比較不同miR-219和COX-2蛋白患者的3年生存率，分析NSCLC組織中miR-219和COX-2蛋白水平與其3年生存率的關(guān)系及兩者聯(lián)合預(yù)測新輔助化療患者預(yù)后的價值。結(jié)果NSCLC組miR-219蛋白陽性表達率為48.24%，低于良性組和正常組的73.33%和80.00%，COX-2蛋白陽性水平為61.18%，高于良性組和正常組的20.00%和16.67%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而良性組和正常組中miR-219和COX-2蛋白陽性表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；NSCLC組患者3年生存率為44.71%，且miR-219蛋白陰性表達患者和COX-2蛋白陽性表達患者的3年生存率低于miR-219蛋白陽性表達患者和COX-2蛋白陰性表達患者(P＜0.05)。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，miR-219蛋白陽性表達水平與NSCLC新輔助化療患者3年生存率呈正相關(guān)(r=0.784，P＜0.05)；COX-2蛋白陽性表達率與NSCLC新輔助化療患者3年生存率則呈負相關(guān)(r=-0.783，P＜0.05)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，NSCLC新輔助化療患者miR-219和COX-2蛋白表達聯(lián)合預(yù)測患者的預(yù)后的靈敏度、特異度、準確性、曲線下面積、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為97.37%、95.74%、96.47%、0.775、94.87%和97.83%。結(jié)論NSCLC新輔助化療患者miR-219蛋白陽性表達率下降而COX-2蛋白陰性表達率上升，且兩者聯(lián)合預(yù)測患者預(yù)后的價值良好，miR-219和環(huán)氧合酶-2表達水平可能作為NSCLC新輔助化療患者預(yù)后評估的參考指標。

非小細胞肺癌；微小核糖核苷酸-219；環(huán)氧合酶-2；新輔助化療；預(yù)后

非小細胞肺癌的惡性程度高，病情進展快，對其進行有效的治療十分重要。由于手術(shù)禁忌證、費用昂貴等問題，非小細胞肺癌的治療目前以放化療為主[1]。新輔助化療是化療方案的一種，可減小腫瘤體，預(yù)防腫瘤遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生和提高化療局控率[2]。然而非小細胞肺癌患者的死亡率亦仍較高，患者預(yù)后較差。其早期預(yù)后評估和及時干預(yù)對其預(yù)后的改善具有重要意義。微小核苷酸219是微小RNA中的一種，2012年劉彥偉等[3]的研究表明其與人腦成膠質(zhì)瘤密切相關(guān)，可通過多個靶點控制人腦成膠質(zhì)瘤的進展。環(huán)氧合酶2已被證明與腫瘤血管生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的腫瘤相關(guān)因子[4]。因此微小核苷酸219(miR-219)和環(huán)氧合酶2(COX-2)均可能與非小細胞肺癌患者病情和預(yù)后相關(guān)。本研究通過檢測非小細胞肺癌組織中miR-219和COX-2的表達水平，探討兩者聯(lián)合預(yù)測采用新輔助化療治療患者預(yù)后的價值，旨在為非小細胞肺癌預(yù)后的評估和改善提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月至2015年1月期間我院應(yīng)用纖維支氣管鏡活檢所得的85例NSCLC組織(NSCLC組)、30例肺部良性病變組織(良性組)和30例正常肺組織(正常組)。納入標準：NSCLC組和良性組均經(jīng)細胞學(xué)或組織學(xué)檢查證實，取樣前均未經(jīng)放化療等治療，三組資料齊全且所有受檢者均對實驗知情同意。排除標準：排除合并小細胞肺癌或其他惡性腫瘤患者、伴嚴重肝腎心臟嚴重功能損傷患者或不同意參與者。85例NSCLC患者中男性58例，女性27例；年齡28～78歲，平均(49.68±8.78)歲。良性組患者中男性20例，女性10例，年齡25～76歲，平均(49.12±8.49)歲。正常組中男性21例，女性9例，年齡25～79歲，平均(49.47±7.95)歲。NSCLC組、良性組和正常組的性別、年齡等基本資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 NSCLC組均采用新輔助化療治療，具體方案為培美曲塞(500 mg/m2，dl)聯(lián)合順鉑(75 mg/m2，dl)，將培美曲塞500 g采用0.9%的氯化鈉注射液稀釋為100 mL后靜脈滴注，靜脈滴注時間需為10 min以上，同時將順鉑溶于250 mL 5%葡萄糖溶液中并行靜脈滴注，每天尿量低于2 000 mL的患者加用甘露醇利尿，21 d/次，共化療兩個療程。化療期間患者無中性粒細胞減少，5例患者出現(xiàn)血小板減少，85例患者出現(xiàn)尚可耐受的惡心、嘔吐、頭暈等胃腸道反應(yīng)?；熀缶S訪3年。

1.3 檢測方法 采用免疫組化法檢測NSCLC組、良性組和正常組標本中miR-219和COX-2蛋白的表達水平，具體如下：①三組標本均為纖維支氣管鏡活檢所得標本，并于取樣后經(jīng)10%的中性福爾馬林固定、石蠟包埋；②采用德國Leica PM2135切片機將標本切成4μm的連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，100%、95%、90%、85%、80%、75%不同濃度的酒精行梯度脫水，采用預(yù)先配備的PBS液沖洗3次，5 min/次；③枸緣酸液行高壓抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，5 min/次。④添加3%過氧化氫溶液并于室溫中孵育15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS液沖洗3次，5 min/次；⑤pH 9.0 EDTA修復(fù)液修復(fù)，冷卻至室溫，PBS液沖洗3次，5 min/次；⑥除去PBS液體，添加聚合物增強劑，添加山羊血清，室溫孵育20 min，去血清分別加入一滴一抗，4℃環(huán)境中過夜，PBS液沖洗3次，5 min/次；⑦每張切片滴加一滴二抗，室溫孵育30 min，PBS液沖洗3次，5 min/次；⑧每張切片均滴加新鮮配備的DAB顯色并于顯微鏡下觀察顯色，顯色滿意后采用自來水沖洗；⑨行蘇木精復(fù)染，再次行梯度酒精脫水(同②)、二甲苯透明后封片。統(tǒng)計隨訪期間NSCLC組患者的生存情況并計算3年生存率。

1.4 染色評價[5]COX-2表達于細胞漿或細胞膜，miR-219表達于細胞膜，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。隨機選取10個高倍視野觀察染色超范圍及著色程度，根據(jù)觀察結(jié)果分為：無陽性著色為陰性(-)，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒細胞低于10%為弱陽性(+)，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒細胞低于10%～30%為中度陽性(++)，出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒細胞低于30%～100%為強陽性(+++)，陽性表達率=(弱陽性例數(shù)+中度陽性例數(shù)+強陽性例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析法，采用受試者操作特性曲線(ROC)分析NSCLC新輔助化療患者miR-219和COX-2蛋白表達情況聯(lián)合預(yù)測其預(yù)后情況的價值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組受檢者的miR-219和COX-2蛋白陽性表達率比較 良性組和正常組中miR-219和COX-2蛋白陽性表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。NSCLC組miR-219蛋白陽性表達率低于良性組和正常組，COX-2蛋白陽性水平則高于良性組和正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 三組受檢者的miR-219和COX-2蛋白陽性表達比較[例（%）]

2.2 NSCLC組及不同miR-219和COX-2蛋白表達患者的3年生存率比較 85例NSCLC組患者中3年存活者 38例，3年存活率為44.71%(38/85)。miR-219蛋白陰性表達患者的3年生存率為34.09% (15/44)，低于miR-219蛋白陽性表達患者的56.10% (23/41)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.158，P＜0.05)；COX-2蛋白陽性表達患者3年生存率為30.77%(16/52)，低于COX-2蛋白陰性表達患者的66.67%(22/33)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.524，P＜0.05)。

2.3 miR-219和COX-2蛋白表達與NSCLC新輔助化療患者3年生存率的關(guān)系 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，NSCLC新輔助化療患者miR-219蛋白陽性表達患者的3年生存率較長，miR-219蛋白陽性表達水平與NSCLC新輔助化療患者3年生存率呈正相關(guān)(r=0.784，P＜0.05)；NSCLC新輔助化療患者COX-2蛋白陽性陽性表達患者的3年生存率較短，COX-2蛋白陽性表達率與NSCLC新輔助化療患者3年生存率則呈負相關(guān)(r=-0.783，P＜0.05)。

2.4 miR-219和COX-2蛋白表達聯(lián)合預(yù)測NSCLC新輔助化療患者預(yù)后的價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，NSCLC新輔助化療患者miR-219和COX-2蛋白陽性表達率聯(lián)合預(yù)測其預(yù)后情況的價值良好，其靈敏度、特異度、準確性、曲線下面積、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為97.37%、95.74%、96.47%、0.775、94.87%和97.83%，見圖1。

圖1 NSCLC新輔助化療患者miR-219和COX-2蛋白表達聯(lián)合預(yù)測其3年生存率的ROC曲線

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤，其病情發(fā)展快，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和死亡率高，患者預(yù)后極差，是我國城市人口惡性腫瘤死亡的首要原因，且已成為全世界范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康和生命安全的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤疾病[6-7]。肺癌中超過80%為非小細胞肺癌[8]。非小細胞肺癌的治療方法目前主要有手術(shù)、放化療、免疫療法和中醫(yī)中藥療法，其中手術(shù)治療是肺癌最重要的治療方法[9]。然而由于肺癌的手術(shù)療法局限性較大且其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，放化療等綜合治療在肺癌治療中越來越受到重視。新輔助化療目前已在多個臨床研究中取得了良好的效果，對提高患者生存率和改善患者生存質(zhì)量等方面均具有重要價值，且無手術(shù)的難度和風(fēng)險[10]。新輔助化療受到越來越多的人們的重視，然而仍存在部分肺癌患者生存期短，預(yù)后情況差。因此對肺癌患者的預(yù)后預(yù)測和早期干預(yù)亦十分重要。在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中，DNA異常甲基化可導(dǎo)致微小RNA等抑癌基因的失活和癌基因的激活[11]。因此miR-219可能與非小細胞肺癌病情和預(yù)后相關(guān)。COX-2又稱前列腺素過氧化物合成酶，是膜結(jié)合型蛋白，可參與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是快速反應(yīng)基因[12]。因此COX-2亦可能與非小細胞肺癌患者的病情和預(yù)后相關(guān)。然而目前關(guān)于COX-2和miR-219兩者聯(lián)合預(yù)測非小細胞肺癌患者預(yù)后的研究較少。

本研究結(jié)果顯示，非小細胞肺癌組織中miR-219蛋白的陽性表達率較低，明顯低于肺良性病變患者和健康患者，提示miR-219與非小細胞肺癌可能相關(guān)。非小細胞肺癌組織中COX-2的陽性表達率較高，明顯高于肺良性病變患者和健康患者，提示COX-2亦可能與非小細胞肺癌相關(guān)。非小細胞肺癌行新輔助化療患者的3年生存率不足50%，患者預(yù)后情況差，其預(yù)后的早期預(yù)測和干預(yù)亦改善預(yù)后情況十分重要。非小細胞肺癌組織中miR-219蛋白陰性表達的行新輔助化療患者的3年生存率高于陽性表達患者，提示miR-219可能與非小細胞肺癌行新輔助化療患者的預(yù)后相關(guān)，這與miR-219可能與非小細胞肺癌病情和預(yù)后相關(guān)的假設(shè)一致。進一步Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，NSCLC新輔助化療患者miR-219蛋白陽性表達患者的3年生存率高，miR-219蛋白陽性表達水平與NSCLC新輔助化療患者3年生存率呈正相關(guān)，進一步證實了非小細胞肺癌病情和預(yù)后相關(guān)的假設(shè)。非小細胞肺癌組織中COX-2陽性表達的新輔助化療患者的3年生存率低于其陰性表達患者，這與COX-2亦可能與非小細胞肺癌患者的病情和預(yù)后情況相關(guān)的假設(shè)一致。進一步Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，NSCLC新輔助化療患者COX-2蛋白陽性陽性表達患者的3年生存率較短，COX-2蛋白陽性表達率與NSCLC新輔助化療患者3年生存率則呈負相關(guān)，進一步證實了COX-2可能與非小細胞肺癌患者的病情和預(yù)后情況相關(guān)的假設(shè)。其機制可能是miR-219可通過抑制癌基因的表達而起到抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]，因此miR-219陰性表達患者腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移受到抑制，患者預(yù)后情況良好，而COX-2調(diào)控其下游PEG2、VEGF、bcl-2等蛋白的表達而促進腫瘤細胞增殖和血管生成相關(guān)[14]，因此COX-2陰性表達患者的預(yù)后情況較差。ROC曲線分析結(jié)果顯示miR-219和COX-2蛋白表達情況聯(lián)合預(yù)測非小細胞肺癌行新輔助化療患者3年生存率的靈敏度、特異度、準確性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均達90%以上，miR-219和COX-2蛋白表達情況聯(lián)合預(yù)測非小細胞肺癌行新輔助化療患者預(yù)后情況的價值良好。出現(xiàn)miR-219陰性表達和COX-2蛋白陽性表達的非小細胞肺癌患者需警惕其不良預(yù)后的發(fā)生，改變治療方法，可進一步采用綜合治療方法進行干預(yù)以改善患者的預(yù)后情況。

綜上所述，非小細胞肺癌患者的miR-219蛋白陰性表達率和COX-2蛋白陽性表達率均較高且兩者聯(lián)合預(yù)測新輔助化療患者預(yù)后的價值良好，可能用于非小細胞肺癌新輔助化療患者預(yù)后的早期評估，從而為其預(yù)后的干預(yù)和改善提供依據(jù)。

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Value of combined detection of miR-219 and cyclooxygenase-2 in predicting prognosis of patients with non-small cell lung cancer treated with neoadjuvant chemotherapy.

LIN Hai-yong,LI Shi-jia,HUANG Wei-fu. Department of Oncology,the Second People's Hospital of Pingnan,Guigang 537307,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the value of tiny ribonucleotid-219(MiR-219)and cyclooxygenase-2 (COX-2)expression level in predicting prognosis of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)treated with neoadjuvant chemotherapy.MethodsEighty-five NSCLC tissue samples(NSCLC group),30 lung benign lesion tissue samples(benign group)and 30 normal lung tissue samples(normal group)were obtained by fiberoptic bronchoscopy in our hospital from January 2009 to January 2012,and miR-219 and the COX-2 protein expression level of the three groups were detected by immunohistochemical method.The 3-year survival rates of NSCLC group were statistically analyzed,and the 3-year survival rates of patients with different levels of miR-219 and COX-2 protein were compared. Relationship between miR-219,COX-2 protein expression levels in NSCLC tissue samples and its 3-year survival rate were analyzed.The value of miR-219 and COX-2 protein expression levels in predicting prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were also analyzed.ResultsThe positive expression rate of miR-219 proteinin NSCLC group was 48.24%,which was significantly lower than 73.33%of benign group and 80.00%of normal group, while positive expression rate of COX-2 protein(61.18%)was significantly higher than that of benign group and normal group(20.00%and 16.67%),with statistically significant differences(P＜0.05).The positive expression level of miR-219 and COX-2 protein had no statistically significant difference between benign group and normal group(P＞0.05).The 3-year survival rate of NSCLC group was 44.71%,and the patients with negative expression of miR-219 and those with positive expression of COX-2 protein had lower 3-year survival rate than the patients with positive expression of miR-219 and negative expression of COX-2 protein(P＜0.05).Spearman rank correlation analysis showed that positive expression level of miR-219 protein and 3-year survival rates of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were positively correlated(r=0.784,P＜0.05),while positive expression rate of COX-2 protein and 3-year survival rates of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were negatively correlated(r=-0.783,P＜0.05).ROC curve analysis showed that the sensitivity,specificity,accuracy,area under the curve,positive predictive value and negative predictive value of miR-219 and COX-2 protein expression levels in predicting prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy were 97.37%,95.74%,96.47%,0.775,94.87%and 97.83% respectively.ConclusionNSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy had lower miR-219 protein positive expression rate and higher COX-2 protein negative expression rate,and combined detection of miR-219 and COX-2 protein negative has high value in predicting prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy.The expression levels of miR-219 and COX-2 may be taken as reference index for evaluating the prognosis of NSCLC patients treated with neoadjuvant chemotherapy.

Non-small cell lung cancer;Tiny ribonucleotid-219;Cyclooxygenase 2;Neoadjuvant chemotherapy;Prognosis

R734.2

A

1003—6350（2016）20—3289—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.007

2016-03-31)

廣西貴港市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（編號：1408020）

林海永。E-mail：1966244336@qq.com