張風林，崔勇，鮑晶，丁學華，應奇

(1.中國人民解放軍第411醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200081；2.上海長征醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200003)

DLC-1啟動子甲基化與垂體腺瘤侵襲性的關系

張風林1，崔勇1，鮑晶1，丁學華2，應奇1

(1.中國人民解放軍第411醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200081；2.上海長征醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200003)

目的 研究肝癌缺失基因1(DLC-1)啟動子區(qū)CpG甲基化與人垂體腺瘤侵襲性的關系，探討垂體腺瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制。方法收集84例垂體腺瘤標本和6例尸檢時獲得的正常人垂體組織標本，利用實時熒光定量PCR的方法檢測標本中DLC-1的表達水平，利用特異性聚合酶鏈反應(MSP)檢測DLC-1基因啟動子區(qū)CpG甲基化狀態(tài)。結果DLC-1在垂體腺瘤標本中表達下降。6例正常人垂體組織標本中DLC-1基因啟動子區(qū)無甲基化，49例侵襲性垂體腺瘤標本中有19例發(fā)生甲基化(38.78%)，35例非侵襲性垂體腺瘤標本中有3例發(fā)生甲基化(8.57%)，52例功能性垂體腺瘤標本中有15例發(fā)生甲基化（28.84%），32例無功能性垂體腺瘤標本中有7例發(fā)生甲基化(21.88%)。DLC-1在侵襲性垂體腺瘤組與非侵襲性垂體腺瘤組之間發(fā)生甲基化率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，而在功能性垂體腺瘤組與無功能性垂體腺瘤組之間發(fā)生甲基化率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。DLC-1啟動子甲基化與垂體腺瘤DLC-1表達量呈負相關(r=-0.67，P=0.01)。結論DLC-1基因啟動子甲基化跟垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展有關，可作為垂體腺瘤侵襲性發(fā)生的重要標志。

垂體腺瘤；肝癌缺失基因1；侵襲性；甲基化；相關性

垂體腺瘤起源于顱內(nèi)腺垂體細胞，占顱內(nèi)腫瘤的10%～25%，屬于良性腫瘤，但是仍然有近35%的垂體腺瘤生物學特征表現(xiàn)為侵襲性。侵襲性垂體腺瘤易于侵犯海綿竇、蝶竇、鄰近硬腦膜以及顱骨。由于其特殊的病理特征，侵襲性垂體腺瘤全切率低且易于復發(fā)，治療困難。垂體腺瘤的發(fā)病機制尚不完全清楚，近年來的研究表明侵襲性垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的過程，DNA甲基化與垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系[1]。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)抑癌基因肝癌缺失基因1(DLC-1)在垂體腺瘤中表達下調(diào)[2]。本研究中我們分析了84例垂體腺瘤標本和6例尸檢時獲得的正常人垂體組織標本中DLC-1基因表達及其啟動子區(qū)CpG甲基化狀態(tài)，研究其與人垂體腺瘤侵襲性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集上海長征醫(yī)院神經(jīng)外科垂體腺瘤標本84例。其中功能性腺瘤52例(泌乳素腺瘤22例，生長激素腺瘤17例，促腎上腺素腺瘤8例，促甲狀腺素腺瘤5例)，無功能腺瘤32例。腫瘤的侵襲性分組依據(jù)術前影像學檢查以及術中所見，按照改良Hardy's分級，將84例垂體腺瘤分為侵襲性垂體腺瘤組49例和非侵襲性垂體腺瘤組35例，見表1。6例正常人垂體組織由尸檢獲得。

表1 垂體腺瘤病理學分類(例)

1.2 主要試劑 RNA抽提試劑(Trizol Reagent，Invitrogen)，DNA純化試劑盒(Promega Wizard，A1120)，DNA純化回收系統(tǒng)(Promega Wizard Cleanup，A7280)，熱啟動Taq酶(Takara Taq HS)。

1.3 實時熒光定量PCR檢測DLC-1 mRNA的表達 內(nèi)參照采用GAPDH。引物設計：DLC-1的上游引物5'-AGAAAGAAGCCGGACACCATGATCC-3'，下游引物3'-CCTTTGGAAAGTCCATTTGCCACTG-5'。內(nèi)參照基因GAPDH檢測引物如下：上游引物5'-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下 游 引 物3'-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-5'。運用2-△△CT法統(tǒng)計基因的相對表達量。

1.4 特異性聚合酶鏈反應(MSP)檢測DLC-1基因啟動子區(qū)CpG甲基化 首先使用DNA純化試劑盒(Promega，A1120)進行基因組提取。取20 mg組織，加600μL核裂解液，勻漿30 s，65℃孵育30 min，加3μL核酸酶溶液，37℃混勻30 min，室溫冷卻。加200μL蛋白沉淀液，混勻，冰上放置5 min。13 000 r/min離心4 min。干凈離心管中加600μL室溫異丙醇，將上步離心中得到上清轉(zhuǎn)移進來。混勻，離心。棄上清，加500μL室溫70%乙醇，混勻，離心。倒掉乙醇，空氣干燥沉淀15 min。用DNA補液重溶，4℃過夜。UV檢測溶液濃度及純度?；蚪M樣品經(jīng)過UV測定后，取2μg使用亞硫酸氫鈉進行處理，陽性標準品也同時處理。經(jīng)過亞硫酸氫鈉處理模板完畢，使用DNA純化回收系統(tǒng)(Promega，A7280)進行純化，作為PCR的模板使用。最后進行PCR反應。甲基化特異性PCR引物設計：MDLC-F：5'-TTTAAAGATCGAAACGAGGGACG-3'，MDLC-R：3'-CCCAACGACCAACG AAAAAACCCGACTAACG-5'；非甲基化特異性PCR引物設計：UDLC-F：5'-TTTTTTAAAGATTGAAATGAGGGAGTG-3'，UDLC-R：3'-AAACCCAACAAAAA AACCCAACTAACA-5'。反應體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Primer 0.5 μL，純化好的模板2 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2μL，dd H2O 17.2 μL，Takara HS TAQ 0.3 μL。循環(huán)條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃33 s，72℃40 s，72℃8 min，4℃1 h，擴增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳15 min，紫外光照顯帶。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用四格表χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。Spearman相關系數(shù)法檢驗DLC-1啟動子甲基化和垂體腺瘤標本DLC-1表達量的相關性。

2 結 果

2.1 不同組標本中DLC-1的表達量比較 與正常垂體組織相比，DLC-1表達水平在垂體腺瘤組織中明顯下調(diào)(P＜0.01)；進一步比較發(fā)現(xiàn)，DLC-1在侵襲性垂體腺瘤組織中的表達水平明顯低于非侵襲性垂體腺瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而功能性垂體腺瘤與無功能性垂體腺瘤比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 DLC-1在不同性質(zhì)標本中表達水平(±s)

表2 DLC-1在不同性質(zhì)標本中表達水平(±s)

組別 例數(shù)正常垂體組垂體腺瘤組t值P值侵襲性組非侵襲性組6 84 49 35表達量t值P值功能性垂體腺瘤無功能性垂體腺瘤t值P值52 32 0.90±0.22 0.51±0.35 2.683 0.009 0.40±0.38 0.66±0.24 3.568 0.001 0.50±0.35 0.52±0.36 0.252 0.802

2.2 不同組標本中DLC-1啟動子甲基化狀態(tài)比較 正常垂體組織中DLC-1啟動子無甲基化。49例侵襲性垂體腺瘤標本中有19例發(fā)生甲基化(38.78%)，35例非侵襲性垂體腺瘤標本中有3例發(fā)生甲基化(8.57%)，52例功能性垂體腺瘤標本中有15例發(fā)生甲基化(28.84%)，32例無功能性垂體腺瘤標本中有7例發(fā)生甲基化(21.88%)，見圖1。DLC-1侵襲性垂體腺瘤組與非侵襲性垂體腺瘤組之間發(fā)生甲基化率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.64，P=0.02)，侵襲組垂體腺瘤發(fā)生甲基化頻率高。在功能性垂體腺瘤組與無功能性垂體腺瘤組之間發(fā)生甲基化率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.50，P=0.48)，見表3。

圖1 不同組標本中DLC-1啟動子甲基化狀態(tài)

表3 DLC-1啟動子在不同組標本中的甲基化狀態(tài)(例)

2.3 DLC-1啟動子甲基化與垂體腺瘤DLC-1表達量的相關性 DLC-1啟動子甲基化與垂體腺瘤DLC-1表達量呈負相關，相關系數(shù)r=-0.67，P=0.01。

3 討 論

垂體腺瘤屬良性單克隆腫瘤，人群中患病率較高，約16.7%，只有少部分人會產(chǎn)生癥狀[3]。然而仍然有近1/3的垂體腺瘤具有侵襲性，這部分患者癥狀重，治療效果差。目前判斷垂體腺瘤侵襲性的發(fā)生尚無統(tǒng)一標準，主要依賴于影像學檢查及手術所見，具有一定的局限性。如果能找到侵襲性發(fā)生的若干分子標志，將有助于早期判斷垂體腺瘤侵襲性的發(fā)生，從而可以給予患者恰當?shù)膫€體化治療，提高治愈率，減少復發(fā)率。

DLC-1是1998年由Yuan等從人原發(fā)性肝癌細胞中克隆出來的一個候選抑癌基因。DLC-1蛋白是一種GAPs蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞的多種生命活動，包括細胞骨架重組、細胞粘附、細胞周期、細胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄等。DLC-1在很多常見的人類腫瘤中表達下調(diào)或缺失，包括肝癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、腎癌和鼻咽腫瘤等，而DLC-1啟動子甲基化正是DLC-1表達下調(diào)的重要原因[4-5]。在某些非惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了其表達水平降低，如子宮肌瘤和良勝增生的前列腺。已有的研究結果表明DLC-1作為一種人類腫瘤抑制基因廣泛存在[6]，但其在人類垂體腺瘤中的表現(xiàn)尚未有研究。

本研究中筆者發(fā)現(xiàn)DLC-1在垂體腺瘤中表達明顯降低，而DLC-1在侵襲性垂體腺瘤中的表達比非侵襲性垂體腺瘤表達水平更低。進一步研究發(fā)現(xiàn)侵襲組垂體腺瘤中DLC-1啟動子發(fā)生甲基化頻率高。DLC-1表達減少跟啟動子甲基化率明顯相關，提示DLC-1啟動子甲基化正是DLC-1表達減少的重要原因。垂體腺瘤中DLC-1的這一分子特征與其在某些惡性腫瘤中的表現(xiàn)一致，啟動子甲基化導致DLC-1表達減少可能是垂體腺瘤侵襲性發(fā)生發(fā)展的重要機制。功能性垂體腺瘤中DLC-1的表達水平與無功能垂體腺瘤差異無統(tǒng)計學意義，在功能性垂體腺瘤組與無功能性垂體腺瘤組之間DLC-1發(fā)生甲基化率差異亦無統(tǒng)計學意義，說明DLC-1在不同病理類型的垂體腺瘤中可能發(fā)揮同樣的作用。

遺傳學及表觀遺傳學的改變在垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了巨大作用[7]，我們也在組織學上明確了DLC-1在垂體腺瘤與正常組織中的表達差異及其啟動子甲基化狀態(tài)，確認其與腫瘤的侵襲性密切相關，檢測垂體腺瘤DLC-1啟動子甲基化狀態(tài)，有助于判斷腫瘤的風險和預后。下一步我們將在細胞層面利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)導技術導入DLC-1，以期研究DLC-1對垂體腺瘤細胞性狀、活動的影響。

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Relationship between DLC-1 promoter methylation and invasion of pituitary adenomas.

ZHANG Feng-lin1,CUI Yong1,BAO Jing1,DING Xue-hua2,YING Qi1.1.Department of Neurosurgery,the 411thHospital of Chinese PLA, Shanghai 200081,CHINA;2.Department of Neurosurgery,Changzheng Hospital,Shanghai 200003,CHINA

Objective To study the relationship between CpG methylation in promoter region of deleted in liver cancer-1(DLC-1)and invasion of human pituitary adenomas,and to explore the molecular mechanisms of the occurrence and development of the pituitary adenoma.MethodsPituitary tissue samples were collected from patients with pituitary adenomas(n=84)and normal people(n=6,by autopsy).Real-time quantitative PCR was used to detect DLC-1 expression levels,and methylation-specific polymerase chain reaction(MSP)was used to detect the CpG methylation status in promoter region of DLC-1 gene.ResultsDLC-1 expression decreased in samples of pituitary adenomas.The 6 cases of normal human pituitary tissue samples showed no methylation in DLC-1 gene promoter region.Methylation was found in 19 cases(38.78%)among the 49 cases of invasive pituitary adenoma specimens,3 cases(8.57%)among 35 cases of noninvasive pituitary adenomas,15 cases(28.84%)among the 52 cases of functional pituitary adenomas,and 7 cases(21.88%)among 32 cases of non-functional pituitary adenomas.There was a significant difference in the incidence of methylation between the invasive pituitary adenomas group and noninvasive pituitary adenomas group(P＜0.05). There was no significant difference in the incidence of methylation between the functional pituitary adenoma group and the non-functional pituitary adenoma group(P＞0.05).DLC-1 gene promoter methylation was negatively correlated with DLC-1 expression in pituitary adenoma(R=-0.67,P=0.01).ConclusionDLC-1 gene promoter methylation is related to the occurrence and development of pituitary adenomas,which can be used as an important indicator for the occurrence of invasive pituitary adenomas.

Pituitary adenoma;Deleted in liver cancer-1(DLC-1);Invasion;Methylation;Correlation

R736.4

A

1003—6350（2016）20—3283—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.20.005

2016-04-08)

上海市虹口區(qū)衛(wèi)生和計劃生育委員會科研資助課題(編號：虹衛(wèi)1403-21)

應奇。E-mail：yingqi411@sina.com