嚴玉玲，周園紅，葉紅

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443000)

構(gòu)建一種分離培養(yǎng)原代小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞改良方法

嚴玉玲，周園紅，葉紅

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443000)

目的 建立可靠穩(wěn)定的小鼠肺泡Ⅱ上皮細胞(AECⅡ)的分離、原代培養(yǎng)技術(shù)，為進一步研究AECⅡ轉(zhuǎn)分化分泌生長轉(zhuǎn)化因子β1(TGF-β1)等物質(zhì)與乳腺癌休眠細胞激活的相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。方法采用傳統(tǒng)的方法和改良后方法分別提取20只小鼠AECⅡ，將其所提取的細胞數(shù)量進行對比。結(jié)果傳統(tǒng)組小鼠可獲得(4.21±2.31)×106個，改良組小鼠可獲得(13.0±2.20)×106個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而兩組小鼠在體質(zhì)量、年齡以及肺組織重量方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論此改良方法可成功獲得大量穩(wěn)定的AECⅡ，為進一步研究AECⅡ轉(zhuǎn)分化分泌TGF-β1等物質(zhì)與乳腺癌休眠細胞激活的相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。

小鼠肺泡Ⅱ上皮細胞；傳統(tǒng)方法；改良方法；原代培養(yǎng)

肺泡Ⅱ型上皮細胞(typeⅡ alveolar epithelial cells，AEC II)是肺上皮細胞的重要組成部分，具有合成和分泌表面活性物質(zhì)、參與免疫反應(yīng)以及轉(zhuǎn)分化等多種功能[1]。在胚胎及胎兒時期AECⅡ可增殖，但在成人期AECⅡ呈高度分化狀態(tài)，正常情況下是不分裂增殖的[2]。當AECI細胞數(shù)量減少時，發(fā)現(xiàn)AECⅡ可轉(zhuǎn)分化為肺泡Ⅰ 型上皮細胞(type I alveolar epithelial cells，AECⅠ)，整個過程可能與TGF-β1傳導(dǎo)的信號通路有關(guān)[3]，目前還沒有能完全替代AECⅡ的細胞株，為進一步研究AECⅡ轉(zhuǎn)分化分泌TGF-β1等物質(zhì)與轉(zhuǎn)移乳腺癌休眠細胞激活相關(guān)機制，需分離純化AECⅡ。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性昆明種小鼠體質(zhì)量約20 g，共40只(三峽大學(xué)實驗動物中心)。DMEM培養(yǎng)基、血清(GIBCO)；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、肝素鈉、Dnase I (Solarbio)；小鼠IgG(Beyotime)；紅細胞裂解液(谷歌生物)；100、200目細胞篩；倒置顯微鏡。

1.2 方法 40只昆明種小鼠隨機分為傳統(tǒng)組與改良組，每組各20只，分別采用傳統(tǒng)方法與改良方法分離提取并純化AECⅡ。

1.2.1 傳統(tǒng)方法

1.2.1.1 小鼠IgG包被培養(yǎng)皿 用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液稀釋小鼠IgG溶液1 mg/mL，將溶液平鋪六孔板并輕晃使其完全覆蓋板底(濃度0.1 mg/cm2)，于37℃培養(yǎng)3～4 h，吸出小鼠IgG溶液，備用[4]。

1.2.1.2 小鼠AECⅡ的分離 昆明種小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛0.2～0.3 mL，麻醉后將小鼠全身浸泡于75%酒精中(避免頭部以免進入肺部)，在超凈臺中盡快打開小鼠的胸腔分離出氣管，打開腹腔剪斷腹主動脈放血，放血完成后止血鉗夾閉近端氣管，進行氣管插管PBS 1 mL灌洗，反復(fù)3次，完整取下肺組織，調(diào)整重量約0.05 g，然后將0.25%胰蛋白酶跟Ⅰ型膠原酶各3 mL灌入肺泡腔(未能完全灌入的溶液浸泡肺組織即可)，于37℃水浴20 min，為中止消化，隨即加入與消化液等體積的DMEM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為10%胎牛血清)并混勻，盡量除去氣管、血管組織、支氣管，然后用剪刀將肺組織剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊(剪碎過程中加入100μL雙抗)；移入50 mL離心管，向懸液加入100μL Dnase I酶，混勻后37℃水浴5 min，分別經(jīng)100、200目細胞篩網(wǎng)過濾，800 r/min離心10 min去上清，然后用紅細胞裂解液3 mL重懸細胞，室溫靜置5～10 min后800 r/min離心5 min去上清，用DMEM培養(yǎng)基5 mL重懸細胞。

1.2.1.3 小鼠AECⅡ純化與培養(yǎng) 將細胞懸液接種至已包被小鼠IgG備用的孔板中，置于體積分數(shù)為5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，吸出培養(yǎng)基(未貼壁的細胞)，800 r/min離心10 min后去上清，用DMEM培養(yǎng)基5 mL重懸細胞，細胞計數(shù)后接種于六孔板中，置于相同條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，在倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞的生長情況。

1.2.2 改良方法

1.2.2.1 小鼠IgG包被培養(yǎng)皿 用PBS溶液稀釋小鼠IgG溶液1 mg/mL，將溶液平鋪六孔板并輕晃使其完全覆蓋板底(濃度0.1 mg/cm2)，于37℃培養(yǎng)3～4 h，吸出小鼠IgG溶液，備用[4]。

1.2.2.2 小鼠AECⅡ的分離 昆明種小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛0.2～0.3 mL，麻醉后將小鼠全身浸泡于75%酒精中(避免頭部以免進入肺部)，在超凈臺中盡快打開小鼠的胸腔分離出氣管，打開腹腔剪斷腹主動脈放血，放血完成后止血鉗夾閉近端氣管，進行氣管插管PBS 1 mL灌洗，反復(fù)3次，然后完整取下肺組織，調(diào)整重量約0.05 g，將組織浸沒于預(yù)冷的PBS液中，盡量去除氣管、血管組織、支氣管，PBS液沖洗組織數(shù)遍后將肺組織剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊(剪碎過程加入100μL雙抗)；移入50 mL離心管，分別按1:1加入0.25%胰蛋白酶跟Ⅰ型膠原酶各3 mL，槍頭吹打混勻后37℃水浴震蕩20 min，為中止消化，向消化好的細胞懸液中加入與消化液等量的DMEM培養(yǎng)基，再向懸液加入Dnase I酶100μL，用槍頭充分吹打混勻后37℃水浴震蕩5 min，分別經(jīng)100、200目細胞篩網(wǎng)過濾，400×g低溫離心10 min棄上清，然后用紅細胞裂解液3 mL重懸細胞，室溫靜置5～10 min后400×g低溫離心5 min棄上清，用DMEM培養(yǎng)基5 mL重懸細胞。

1.2.2.3 小鼠AECⅡ的純化與培養(yǎng) 將細胞懸液接種至已包被小鼠IgG備用的孔板中，置于體積分數(shù)為5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，吸出培養(yǎng)基(未貼壁的細胞)，800 r/min離心10 min后去上清，用DMEM培養(yǎng)基5 mL重懸細胞，細胞計數(shù)后接種于六孔板中，置于相同條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后換液，在倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞的生長情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠一般資料比較 傳統(tǒng)組小鼠與改良組小鼠在體質(zhì)量、年齡及肺組織重量方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

組別傳統(tǒng)組(n=20)改良組(n=20) t值P值體質(zhì)量(g) 20.24±1.21 21.19±0.85 1.63＞0.05年齡(周) 5.18±0.40 5.66±0.68 0.89＞0.05肺組織重量(g) 0.048±0.005 0.051±0.005 2.31＞0.05

2.2 兩種方法提取小鼠AECⅡ數(shù)量比較 傳統(tǒng)組小鼠可獲得(4.21±2.31)×106個，改良組小鼠可獲得(13.0±2.20)×106個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 光鏡觀察細胞 培養(yǎng)的AECⅡ約16 h貼壁，細胞呈圓形或橢圓形，24 h后逐漸聚集成島狀生長，AECⅡ胞漿豐富，核仁明顯，內(nèi)含大量反差明顯的細小顆粒(見圖1)。培養(yǎng)約48 h后，細胞逐漸融合成細胞單層。培養(yǎng)大約72 h后，細胞逐漸較前變得扁平，胞內(nèi)細小顆粒明顯減少。培養(yǎng)5～6 d后，無法辨認Ⅱ型肺泡上皮細胞。

圖1 倒置顯微鏡下培養(yǎng)24 h的昆明小鼠AECⅡ細胞(×100)

3 討 論

目前酶消化法是提取原代AECⅡ的主要方法，查閱國內(nèi)外文獻，常用于原代細胞消化的酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶、膠原酶[4-5]。雖然彈性蛋白酶對AECⅡ損傷小且具有消化選擇性，但因這種酶的有效作用時間有限、活性不夠穩(wěn)定、容易降解等問題，故本實驗選擇的是胰蛋白酶聯(lián)合膠原酶消化法提取原代AECⅡ。

與其他原代細胞分離、培養(yǎng)相似，酶消化法分離AECⅡ也存在細胞聚集成團、雜細胞污染、細菌污染等問題，本實驗就此做了如下改進：

在分離AECⅡ過程中，由于剪碎組織及酶對細胞的損傷會使細胞釋放DNA。為防止細胞釋放出來的DNA與細胞外基質(zhì)形成DNA蛋白復(fù)合物，本實驗采用脫氧核糖核酸酶(DnaseⅠ)來避免細胞聚集成團。

肺組織中有40多種不同的細胞。由于胰蛋白酶消化沒有選擇性，除AECⅡ外，還含有巨噬細胞、紅細胞、成纖維細胞等雜細胞。為達到實驗研究要求需將提取的AECⅡ進一步純化。目前純化AECⅡ的方法很多，如密度梯度離心、免疫粘附、濾膜分離、流式細胞技術(shù)。Zeng等[6]使用一種新型的微流體磁性細胞分選系統(tǒng)來分選肺多能干細胞，結(jié)果較為理想。本實驗純化AECⅡ的方法如下：①差速離心法去除成纖維細胞，利用AECⅡ和細胞之間的比重差異，當轉(zhuǎn)速在400×g時，可使部分成纖維細胞仍懸浮于培養(yǎng)基而無法沉淀，從而能將部分成纖維細胞去除。傳統(tǒng)的方法離心力轉(zhuǎn)數(shù)太低，部分Ⅱ型上皮細胞無法完全沉淀，將導(dǎo)致細胞得率低。②免疫粘附法純化AECⅡ，因為巨噬細胞和其他大多數(shù)非Ⅱ型細胞表面都有IgG上的Fc片段的受體，因其含有Fc片段的受體而與小鼠IgG抗體結(jié)合，吸附到板底上，不粘附的AECⅡ則不貼板底[7]。紅細胞裂解液去除紅細胞，雖然取肺組織之前進行了放血處理，但是AECⅡ中仍然混有紅細胞，故使用紅細胞裂解液裂解紅細胞，但對AECⅡ并無影響。

細菌污染是原代細胞培養(yǎng)中普遍存在的問題。在前5次試驗中，盡管采取了常規(guī)的動物消毒及無菌操作，但由于沒有在剪碎組織過程中加入雙抗，每次均出現(xiàn)細菌污染問題。為此，本實驗在剪碎組織過程中加入雙抗，克服了細胞被污染的難題。

此外，為進一步提高AECⅡ數(shù)量，本實驗通過先剪碎組織再用酶消化(水浴震蕩)方法來增加酶接觸組織面積，達到充分消化的作用。Ⅱ型肺泡上皮細胞比較脆弱，在體外環(huán)境下易損傷，故整個實驗過程時間最好不超過4 h，實驗過程中最好使用新的剪刀，使用槍頭吹打細胞時動作應(yīng)輕柔，保持低溫條件也是實驗成功的關(guān)鍵[5]。

[1]Herzog EL,Brody AR,Colby TV,et al.Knowns and unknowns of the alveolus[J].Proceedings o the American Thoracic Society,2008, 5(7):778-782.

[2]Lee J,Reddy R,Barsky L,et al.Contribution of proliferation and DNA damage repair to alveolar epithelial type 2 cell recovery from hyperoxia[J].American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology,2006,290(4):L685-L694.

[3]Bhaskaran M,Kolliputi N,Wang Y,et al.Trans-differentiation of alveolar epithelial typeⅡcells to typeⅠcells involves autocrine signaling by transforming growth factor β1through the Smad pathway [J].Journal of Biological Chemistry,2007,282(6):3968-3976.

[4]鄭金旭.構(gòu)建原代分離培養(yǎng)與鑒定小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的方法及模型[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(15): 2761-2762.

[5]Gonzalez RF,Dobbs LG.Isolation and culture of alveolar epithelial TypeⅠand TypeⅡcells from rat lungs[M].Second Edition.Epithelial Cell Culture Protocols,2013:145-159.

[6]Zeng L,Qiu L,Yang XT,et al.Isolation of lung multipotent stem cells using a novel microfluidic magnetic activated cell sorting system[J].Cell Biology International,2015,39(11):1348-1353.

[7]Chen J,Chen Z,Narasaraju T,et al.Isolation of highly pure alveolar epithelial typeⅠand typeⅡcells from rat lungs[J].Laboratory Investigation,2005,85(9):1181.

An improved method for the isolation and primary culture of mouse AECⅡ.

YAN Yu-ling,ZHOU Yuan-hong,YE Hong.Department of Gynaecology and Obstetrics,First School of Clinical Medicine,China Three Gorges University,Yichang 443000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo establish a reliable and stable mouse typeⅡalveolar epithelial cells(AECⅡ)isolation and primary culture technology for further study in the mechanism of trans-differentiation of AECⅡto TGF-β1and to other substances associated with the activation of dormant cells of breast cancer.MethodsThe amount of mouse AECⅡextracted from both conventional group and improved group were compared.ResultsA total of(4.21±2.31)× 106mouse AECⅡwere obtained from the conventional group,while only(13.0±2.20)×106were obtained from the improved group.The difference was statistically significant(P＜0.05).However,there were no statistically significant difference in the weight,age,and weight of the lung tissue between the conventional group and improved group(P＞0.05).ConclusionThe improved method could gain a large quantity of stableAECⅡ,which offers a foundation for further study in the mechanism of trans-differentiation of AECⅡto TGF-β1and to other substances associated with the activation of dormant cells of breast cancer.

AECⅡ;Conventional methods;Improved method;Primary culture

R-332

A

1003—6350（2016）20—3280—03

2016-03-18)

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（編號：81402404）

葉紅。E-mail：yehong998@126.com