周 萍， 樊 靜， 梁

(成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052)

一種簡(jiǎn)易小鼠原代肝細(xì)胞分離方法

(成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所， 四川 成都 610052)

對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞分離方法進(jìn)行改良，通過(guò)簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)的方法獲得小鼠原代肝細(xì)胞，采用4.5號(hào)輸液針經(jīng)下腔靜脈逆行灌流，用長(zhǎng)條狀紙板對(duì)針進(jìn)行固定，以獲取質(zhì)量穩(wěn)定的小鼠原代肝細(xì)胞懸液.結(jié)果顯示，改進(jìn)后的方法灌流成功率高及重現(xiàn)性好并可獲得實(shí)驗(yàn)所需肝細(xì)胞，細(xì)胞對(duì)臺(tái)盼藍(lán)拒染率>90%.方法操作簡(jiǎn)單，成本較低且效率較高.

灌流;小鼠原代肝細(xì)胞;Ⅳ型膠原酶

0 引 言

小鼠原代肝細(xì)胞是肝臟疾病及體外肝毒性研究的重要工具，探索一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)的小鼠肝細(xì)胞分離方法非常具有實(shí)際意義.相對(duì)于大型動(dòng)物及人體原代肝細(xì)胞，小鼠原代肝細(xì)胞更經(jīng)濟(jì)且易獲取.肝細(xì)胞的經(jīng)典分離方法是Seglen兩步原位灌注法[1]，該方法適用于大鼠以及較大動(dòng)物肝細(xì)胞的分離.近年來(lái)，在Seglen兩步原位灌注法基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的適用于小鼠肝細(xì)胞分離方法有門(mén)靜脈灌流[2]、下腔靜脈灌流[3]、心臟逆行灌流[4].在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，因小鼠門(mén)靜脈血管細(xì)小，壁薄易被輸液針扎破而導(dǎo)致灌流失敗或灌注不均勻較難穿刺并置管成功，但小鼠的下腔靜脈血管比其門(mén)靜脈血管粗，經(jīng)下腔靜脈的灌流方法比門(mén)靜脈更易置管成功.文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠灌流多采用留置針及灌流泵，留置針的灌流采用手扶固定或膠帶固定，容易出現(xiàn)針固定不好而脫落的情況，采用紙板固定針頭能夠很好避免針脫落.小鼠肝臟體積小，細(xì)微的灌流泵調(diào)節(jié)都會(huì)引起小鼠肝內(nèi)壓力驟變而對(duì)肝細(xì)胞造成損傷，或使肝臟及相關(guān)血管因壓力過(guò)大而破裂漏液，采用注射器推注的方式能夠較好地避免因灌流泵調(diào)節(jié)的灌流壓過(guò)大所致的肝臟或血管漲裂的情況發(fā)生，且簡(jiǎn)單易行.在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)改良了灌流方式，采用4.5號(hào)輸液針，對(duì)灌流針的進(jìn)針位置及灌流針固定方法進(jìn)行了探索，擬建立一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)的灌注實(shí)驗(yàn)方法，以降低人為操作的影響及實(shí)驗(yàn)成本.

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為：KM小鼠40只(22±2 g，雌雄不限)，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于SPF系統(tǒng)中.

1.2 試 劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)，EGTA、胰島素、地塞米松(sigma)，D-HANKS(Gibco公司)，鼠尾膠原蛋白Ⅰ型(solarbio C8062)，臺(tái)盼藍(lán)(sigma T6146)，高糖DMEM(HyClone)，青鏈霉素(solarbio)，HEPES(Amresco).

1.3 溶液配制

1)灌流液Ⅰ配制.將0.019 g EGTA溶于100 mL D-HANKS，用NaOH溶液調(diào)至pH值為7.2～7.4.

2)灌流液Ⅱ配制.Ⅳ型膠原酶40 mg溶于100 mL高糖DMEM.

3)醋酸溶液的配置.34.3 μL冰醋酸用蒸餾水定容到100 mL，配置成0.006 mol/L醋酸溶液.

4)水合氯醛.稱(chēng)取0.8 g水合氯醛溶解于20 mL生理鹽水.

5)100 nmol/L地塞米松.精密稱(chēng)取地塞米松19.5 mg溶于1 mL無(wú)水乙醇，取100 μL加入到50 mL DMEM中，分裝，-20 ℃低溫冷藏.

6)10 nmol/L胰島素.精密稱(chēng)取胰島素2.9 mg溶于pH值為2～3的50 mL鹽酸中超聲溶解，分裝，-20 ℃低溫冷藏.

7)細(xì)胞培養(yǎng)液的配制.10%胎牛血清、0.5 mL青鏈霉素、44.5 mL高糖DMEM、5 μL胰島素，50 μL地塞米松.

1.4 小鼠肝細(xì)胞分離及培養(yǎng)

取0.006 mol/L冰醋酸3 mL及鼠尾膠原6 μL加入3.5 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，搖勻，密封，4 ℃靜置過(guò)夜，輕吸出細(xì)胞培養(yǎng)皿殘余液體，超凈臺(tái)內(nèi)烘干，PBS沖洗3次，備用.灌流液Ⅰ及灌流液Ⅱ現(xiàn)用現(xiàn)配，灌流液Ⅱ40 ℃提前水浴1 h，灌流液Ⅰ臨用時(shí)放入40 ℃水浴.固定小鼠，經(jīng)腹腔注射0.35 mL水合氯醛麻醉，75%酒精噴灑腹部皮膚,分離腹部皮膚，換手術(shù)器械后剪開(kāi)腹腔，將腸管及腸系膜輕輕翻向小鼠左側(cè)，暴露出門(mén)靜脈及下腔靜脈，注射器吸取灌流液并排盡空氣，在針柄處用膠帶固定一張長(zhǎng)條狀滅菌紙板.下腔靜脈穿刺，使針尖位置稍微高于2 mm腎靜脈，血管夾固定進(jìn)針處以防止灌流液倒流，小心將紙板固定，輕輕推注，通過(guò)肝臟輕微膨大判斷進(jìn)針成功與否(見(jiàn)圖1)，對(duì)照組針柄用醫(yī)用膠帶固定.灌流液Ⅰ緩慢推入，并剪斷門(mén)靜脈灌流至肝臟呈現(xiàn)土黃色(約40 mL).然后將灌流液Ⅱ緩慢推入(約12 mL)，用鑷柄處按壓門(mén)靜脈，肝稍微膨大，停止推注并在30 s后放開(kāi)，每推1 mL輕輕按壓一次,肝臟呈現(xiàn)土黃色并塌陷，灌流結(jié)束，剪下肝臟，去除膽囊，將肝臟轉(zhuǎn)移至盛有8 mL左右細(xì)胞培養(yǎng)基中，撕開(kāi)肝包膜，用眼科鑷夾住肝蒂輕輕晃動(dòng)，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，得到肝細(xì)胞懸液.500 r/min離心2次，調(diào)整肝細(xì)胞的密度，每個(gè)培養(yǎng)皿接種肝細(xì)胞1×106，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，4 h以后觀察并換液，細(xì)胞培養(yǎng)觀察.

圖1 經(jīng)下腔靜脈逆行灌注肝臟，輸液針針柄處紙板固定

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)資料應(yīng)用樣本率的χ2進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05.

2 結(jié) 果

2.1 小鼠灌流成功率

在實(shí)驗(yàn)組25例和對(duì)照組15例中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別有24例和9例一次性穿刺成功并固定，分別各有1例出現(xiàn)灌注不均勻，其中對(duì)照組有4例出現(xiàn)液體外滲，針刺破血管而導(dǎo)致小鼠出血性死亡，1例出現(xiàn)未能成功穿刺導(dǎo)致出血性死亡.經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS計(jì)算p<0.05，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組灌流成功率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2 細(xì)胞存活率與培養(yǎng)

分離出的小鼠肝細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，拒染率在90%以上，接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，體外培養(yǎng)4 h，倒置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可以看到95%以上的細(xì)胞呈典型的肝細(xì)胞形態(tài):細(xì)胞呈多邊形，界限清晰，胞體透明，核呈圓形，大部分細(xì)胞為雙核或多核(見(jiàn)圖2).肝細(xì)胞能夠培養(yǎng)一周，可滿足肝細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)需求.

a.接種前，小鼠原代肝細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞透亮呈圓形或卵圓形，較少的細(xì)胞被染色;b.肝細(xì)胞接種3.5 h，肝細(xì)胞貼壁，伸展，變薄，呈圓形或多邊形，邊界明顯，可見(jiàn)大量雙核，部分三核及單核細(xì)胞；c、d.肝細(xì)胞接種24 h，肝細(xì)胞牢固貼附于培養(yǎng)皿上，拉平變薄，呈橢圓形或多邊形，邊界輪廓清晰，細(xì)胞核位于正中，可見(jiàn)大量雙核及多核細(xì)胞.

圖2 顯微鏡下觀察小鼠原代肝細(xì)胞

3 討 論

近年來(lái)，適用于小鼠肝臟灌流方法有門(mén)靜脈灌流、下腔靜脈灌流、心臟逆行灌流等.通過(guò)這些灌流方法都能分離高活力小鼠原代肝細(xì)胞.小鼠門(mén)靜脈細(xì)小，較難穿刺置管成功，且小鼠灌流時(shí)因呼吸而牽動(dòng)灌流針，常常會(huì)降低灌流成功率.經(jīng)心臟逆行置管灌注法需要剪開(kāi)胸腔，通過(guò)心房插入肝臟上下腔靜脈并分離結(jié)扎門(mén)靜脈以及下腔靜脈，這對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作技能要求較高，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能夠掌握.此外，小鼠肝臟灌流操作中需使用灌流泵及留置針，成本較高.本研究對(duì)經(jīng)下腔靜脈的小鼠肝臟灌流方法進(jìn)行了改良，采用更經(jīng)濟(jì)易獲取的4.5號(hào)輸液針代替留置針，采用人工推注方法代替灌流泵，避免了因灌流泵流速過(guò)大而導(dǎo)致小鼠肝臟破裂，以及開(kāi)始灌流流速過(guò)慢而導(dǎo)致小鼠肝臟血淤的情況發(fā)生.長(zhǎng)條紙板固定針柄處代替?zhèn)鹘y(tǒng)膠帶或手固定方法，能夠有效避免針脫落，降低人為影響.改良后的小鼠肝臟灌注因其簡(jiǎn)便易行，可明顯節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本、提高工作效率及灌流成功率.

在肝細(xì)胞分離及培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)液及灌流液的鈣離子濃度、pH值、溫度、酶濃度、流速以及灌流成功率直接影響肝細(xì)胞質(zhì)量及數(shù)量[5]，優(yōu)化并控制這些條件便能獲得高質(zhì)量肝細(xì)胞.本實(shí)驗(yàn)中，灌流液Ⅰ按照每只小鼠2 mL/g，灌流液Ⅱ按照每只小鼠0.5 mL/g±2 mL，灌流液pH值維持在7.2～7.4，灌流液Ⅰ流速應(yīng)控制為灌流開(kāi)始推注速度較快以防止肝臟形成檳榔狀斑塊，最后穩(wěn)定在18～20 mL/min，灌流液Ⅱ推注速度穩(wěn)定在4～6 mL/min，灌流液溫度穩(wěn)定在38～40 ℃，取得的單細(xì)胞狀態(tài)較好.

目前，小鼠原代肝細(xì)胞分離方法包括灌注分離法[6-8]、胰蛋白酶消化法[9]和組織塊法[10].本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，胰酶消化得到的細(xì)胞數(shù)量較少且雜細(xì)胞較多，難以獲得常規(guī)實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞數(shù)量，且因胰蛋白酶酶對(duì)細(xì)胞損傷過(guò)大，肝細(xì)胞存活率太低不能滿足實(shí)驗(yàn)需求.組織塊法多用于幼年動(dòng)物，成年小鼠不推薦胰蛋白酶消化法和組織塊法分離原代肝細(xì)胞.本實(shí)驗(yàn)采用的小鼠肝臟灌流方法的改良，操作簡(jiǎn)單易掌握，操作程序及手術(shù)程序簡(jiǎn)單可控，提高了工作效率，具有較高的推廣價(jià)值.

[1]Seglen P O.Preparationofisolatedratlivercells[J].Methods Cell Biol,1976,13(13):29-83.

[2]Zheng J Y,Chuan P,Ai Y B,et al.Docosahexaenoicacidamelioratesfructose-inducedhepaticsteatosisinvolvingERstressresponseinprimarymousehepatocytes[J].Nutrients,2016,8(1):55.

[3]Ghose R,Mallick P,Taneja G,et al.InvitroapproachestostudyregulationofhepaticcytochromeP450(CYP) 3Aexpressionbypaclitaxelandrifampicin[J].Methods Mol Biol,2016,1395:55-68.

[4]余招焱,白燕南,張濤,等.經(jīng)心臟逆行置管灌注法在小鼠原代肝細(xì)胞分離中的應(yīng)用[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,45(1):138-141.

[5]Li W C，Ralphs K L,Tosh D,et al.Isolationandcultureofadultmousehepatocytes[J].Methods Mol Biol,2010,633(8):185-196.

[6]Itoh Y,Sanosaka M,Fuchino H,et al.Salt-induciblekinase3signalingisimportantforthegluconeogenicprogramsinmousehepatocytes[J].J Biol Chem,2015,290(29):17879-17893.

[7]Cook J R.Langlet F,Kido Y,et al.Pathogenesisofselectiveinsulinresistanceinisolatedhepatocytes[J].J Biol Chem,2015,290(22):13972-13980.

[8]張丁丁,辛永寧,羅兵,等.一種簡(jiǎn)化的分離與培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞的方法[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,50(1):34-36.

[9]王琳,徐建波,田元,等.一種分離新生小鼠肝細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2007,15(1):10-12.

[10]Bangs，F(xiàn)iona K,Schrode,et al.Lineagespecificityofprimaryciliainthemouseembryo[J].Nat Cell Biol，2015,17(2):113-122.

Simple Separation Method for Mouse Primary Hepatocyte

ZHOUPing,FANJing，LIANGWei

(Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu University， Chengdu 610052, China)

The paper studies how to improve the separation method for mouse primary hepatocyte in order to obtain the mouse primary hepatocyte in the most simple and economic way.Retrograde infusion is done by using infusion needles through the inferior vena cava.Then,the needles are fixed by long strip paperboard.In this way,stable suspension of mouse primary hepatocyte can be obtained.As a result,the success rate of the improved retrograde infusion is extremely high and the repetition is also excellent.The hepatocyte needed for experirnents can be obtained.The rate of trypan blue stain-resistance is more than 90%.This method is simple in operation,low in cost and high in efficiency.

perfusion;mouse primary hepatocyte;collagenase Ⅳ

1004-5422(2016)04-0328-03

2016-09-26.

周 萍(1990 — )， 女， 碩士研究生， 從事細(xì)胞分離與病理學(xué)研究.

R965.2；R329.2

A