郭亞雷

（河北省武安市職教中心 056300）

人工誘導(dǎo)葡萄多倍體鑒定研究進(jìn)展

郭亞雷

（河北省武安市職教中心 056300）

介紹葡萄多倍體人工獲得的途徑，闡述和總結(jié)葡萄多倍體鑒定方法，并對近幾年探索的一些新方法做系統(tǒng)介紹。

葡萄；多倍體；倍性鑒定

多倍體植物在自然界中普遍存在。據(jù)調(diào)查，在果樹中約有半數(shù)以上的樹種含有多倍體類型或?yàn)槎啾扼w[1]。例如：蘋果、梨、葡萄等，都含有多倍體類型。果樹多倍體類型與普通二倍體類型相比具有果實(shí)大，生長旺盛，產(chǎn)量高，抗逆性和適應(yīng)性強(qiáng)，果實(shí)無籽或少籽的特點(diǎn)[2]，并且可以以嫁接等無性繁殖的方式使其優(yōu)良性狀得到穩(wěn)定的延續(xù)[3]。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，果樹多倍體的選擇與育種工作受到越來越多的關(guān)注，已成為育種工作者所青睞的對象。葡萄多倍體的選擇為生產(chǎn)大粒葡萄和無核葡萄提供了廣闊的空間，從而創(chuàng)造了巨大的科研和經(jīng)濟(jì)價值。

1 葡萄多倍體人工獲得途徑

伴隨著鮮食葡萄需求的日益增長，多倍體葡萄以其早熟、果粒大、種子少或無深受市場和消費(fèi)者的歡迎。葡萄多倍體的選育工作顯得尤為重要[4]。

在多倍體育種中，常用的人工獲得多倍體的途徑有：物理誘變﹑化學(xué)誘變以及生物學(xué)途徑[5，6]。在葡萄多倍體誘導(dǎo)中化學(xué)方法誘導(dǎo)是最常用的方法。其中的秋水仙素是至今發(fā)現(xiàn)的加倍效果最好、使用最廣泛的染色體加倍劑。前人利用秋水仙素來處理種子[7，8]、芽[9]、莖段[10]、莖尖[11]等具有分生能力的組織和器官都獲得了理想的結(jié)果。

此外，還可以通過生物學(xué)來獲得葡萄多倍體。主要包括體細(xì)胞雜交法和2n配子有性多倍化。

但是，無論用哪種方法，植物組織在經(jīng)過多倍化處理后，并不是所有材料的染色體都會加倍，這中間還會產(chǎn)生一些非整倍體和嵌合體。這樣，如何準(zhǔn)確將多倍體挑選出來就成為多倍體研究的重要環(huán)節(jié)。

2 葡萄多倍體鑒定方法

葡萄多倍體的鑒定方法遵從果樹多倍體鑒定方法，有直接鑒定法和間接鑒定法[12]。但是，為了確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般采用兩種方法相結(jié)合。

2.1 直接鑒定法 直接鑒定法即染色體制片法，是進(jìn)行細(xì)胞倍性鑒定最直接、最可靠的方法。直接鑒定法計數(shù)準(zhǔn)確而且不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)儀器，是目前應(yīng)用最多的鑒定方法。

對于采用間接方法初步斷定為多倍體的材料，還應(yīng)鑒定其染色體數(shù)目是否增多，從而為鑒定結(jié)果提供最直接的證據(jù)。對于葡萄來說，染色體計數(shù)法常采用根尖、幼嫩的卷須和嫩梢[13，14]進(jìn)行壓片。也有的在花期鑒定花粉粒來確定染色體的數(shù)目。

根尖是由組織發(fā)生層的LⅢ層衍生而來，因此其細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目變化可以反映 LⅢ層是否發(fā)生倍性變化。檢查根尖細(xì)胞中的染色體數(shù)，不但能區(qū)別倍性，而且能鑒定出是整倍性或非整倍性的變異。

錢春在白香蕉葡萄芽變突變體鑒定及四倍體誘導(dǎo)研究中，首先采用根尖做試驗(yàn)材料進(jìn)行初步鑒定，然后用植株萌發(fā)新梢長出的卷須進(jìn)行連續(xù)鑒定，避免了有些只是根部加倍而地上部不加倍的現(xiàn)象，獲得了理想的結(jié)果[5]。

染色體數(shù)目法要求材料是處于旺盛生長的部位或器官才可以并且需要在顯微鏡下數(shù)至少5個細(xì)胞，才能確認(rèn)某一材料的倍性。要求試驗(yàn)人員具有較高的水平。對于染色體數(shù)目較少的材料還簡單一點(diǎn)，可是對染色體數(shù)目比較多的材料則費(fèi)時費(fèi)力。

大概是因?yàn)橛辛诵┚嚯x，愛情里的美好就顯露出來了，他們都知道其實(shí)他們還愛著，所以在“分手”一個多月的時候，他們還是復(fù)合了。

該方法的步驟一般分為：取材→預(yù)處理→固定→解離→染色→鏡檢[1]。直接鑒定法根據(jù)不同材料各步驟略有不同，它包括常規(guī)壓片法和去壁低滲法。劉文革等通過對誘導(dǎo)的西瓜和甜瓜植株的根尖細(xì)胞染色體直接計數(shù)進(jìn)行四倍體的倍性鑒定[15]。常金華等運(yùn)用去壁低滲法對人工誘變的四倍體玫瑰香葡萄卷須的染色體進(jìn)行計數(shù)確定倍性[16]。

2.2 間接鑒定法

2.2.1 根據(jù)多倍體果樹生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定 根據(jù)植株器官如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子的形態(tài)、顏色等在各倍性之間的差異來進(jìn)行倍性識別。

一般情況下多倍體較之相應(yīng)的二倍體植株根、莖變粗，葉片變大、加厚、葉色加深、葉形指數(shù)變小，花、果變大，種子形狀大小改變，葉色及花色改變[14]等，在一些植物中可用來初步判斷其倍性水平。

利用形態(tài)學(xué)鑒定倍性簡單、直觀、快速，無需儀器設(shè)備，實(shí)用性強(qiáng)，對熟悉該作物的人準(zhǔn)確率也較高，工作量不大。不足之處是經(jīng)驗(yàn)因素影響大，可能會因人而異，且部分材料需在植株生長發(fā)育較晚時期才能鑒定使育種材料不能得到充分利用。

2.2.2 根據(jù)解剖結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定

2.2.2.1 根據(jù)葉解剖結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行鑒定由于染色體組成倍增加，多倍體在形態(tài)上一般表現(xiàn)出巨大性。細(xì)胞的巨大性是區(qū)別植物多倍體和二倍體的指標(biāo)之一，此外也可根據(jù)葉片柵欄組織的厚薄等進(jìn)行鑒定[16]。

2.2.2.2 根據(jù)氣孔性狀進(jìn)行鑒定 多倍體葉片氣孔增大，氣孔密度下降，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目增多，這些特征可用于倍性鑒定。戴洪義利用保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目和氣孔長度，獲得的鑒定倍性判別方程，用于倍性鑒定獲得了較理想的結(jié)果[17]。

2.2.2.3 根據(jù)梢端組織發(fā)生層細(xì)胞特征進(jìn)行鑒定 芽變選種是無性繁殖植物育種的一種有效途徑，多以嵌合體的形式存在，特別是多倍體芽變。通過檢測梢端分生組織LⅠ、LⅡ、LⅢ三層細(xì)胞的細(xì)胞、細(xì)胞核及核仁的大小，可以鑒定芽變材料倍性嵌合體的類型。齊永順在四倍體玫瑰香倍性鑒定中采用了檢測分生組織LⅠ、LⅡ、LⅢ三層細(xì)胞的細(xì)胞、細(xì)胞核及核仁的大小獲得了理想的結(jié)果[18]。氣孔保衛(wèi)細(xì)胞大小及其中的葉綠體數(shù)是由LⅠ層衍生而來。

2.2.2.4 根據(jù)花粉粒特征進(jìn)行鑒定 花粉粒是由組織發(fā)生層的LⅡ?qū)友苌鴣?，不同倍性的花粉粒性狀上也存在差異。一般認(rèn)為，多倍體植株的花粉粒大、萌發(fā)孔多、花粉粒形狀變化明顯等。同時，多倍體花粉粒大小不均勻，此外因多倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂不正常，致使花粉畸形從而致使不育。三倍體多不育。

2.3 生理生化指標(biāo)鑒定 植物倍性的差異引起生理特性的改變，導(dǎo)致生理生化指標(biāo)的相應(yīng)改變，所以其生理生化指標(biāo)也可作為鑒定植物倍性的依據(jù)。例如持水量、滲透壓、呼吸作用、含糖量、維生素含量、礦物質(zhì)含量、氨基酸含量、光合速率、蒸騰速率及同工酶、酶帶變化等[19]。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

2.4.1 多倍體果樹同工酶電泳譜帶的特征 多倍體與二倍體的種種差異，根本的原因來自于基因的不同，比較多倍體與二倍體的基因組成及表達(dá)的特點(diǎn)，是反映多倍體本質(zhì)的重要內(nèi)容。一般認(rèn)為，多倍體植株同工酶同一位點(diǎn)基因劑量加倍，控制該位點(diǎn)的酶的量相應(yīng)增加，同工酶電泳譜帶的深度因而增加，而二倍體的同工酶電泳譜帶則沒有類似的特征[20]。利用同工酶鑒定果樹倍性的研究并不多，而且此法技術(shù)復(fù)雜，受酶的影響大[1]。為達(dá)到實(shí)用的目的，還需進(jìn)一步研究。

2.4.2 流式細(xì)胞儀鑒定 流式細(xì)胞儀也稱倍性分析儀，是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器。它集電子技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論于一體，可以定量地測定某一個細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量，以及細(xì)胞群體中上述成分含量不同的細(xì)胞數(shù)量[21]。更特別是它可以將某一個特異染色的細(xì)胞從數(shù)以萬計的細(xì)胞群體中分離出來[22]。隨著倍性的增加，DNA含量呈倍性增加趨勢，據(jù)此可判斷其倍性水平。

使用流式細(xì)胞儀分析時，一般將需要檢測的細(xì)胞群體分散，對待測的成分進(jìn)行特殊的染色，然后將懸液中的細(xì)胞以1個細(xì)胞/ms的速度(1 000萬細(xì)胞/h)[22]一個個地通過流式細(xì)胞儀，這樣檢測器就可以測出并且記錄每個細(xì)胞中的待測成分的含量，并根據(jù)要求將該成分含量不同的細(xì)胞分離出來。如果染色過程不影響細(xì)胞活性，那么分離出來的細(xì)胞還可繼續(xù)培養(yǎng)[22]。

近年來，流式細(xì)胞儀用于植物細(xì)胞核DNA含量的研究陸續(xù)在世界各國開展起來，迄今已對玉米、向日葵、甘薯、木薯、獼猴桃與李進(jìn)行過研究，這些研究表明，利用流式細(xì)胞光度術(shù)測定細(xì)胞核DNA含量可鑒定倍性。流式細(xì)胞儀的問世為植物染色體倍性的研究提供了一條便捷的途徑，鑒定快速方便，且準(zhǔn)確性較高[23]。

3 討論

染色體倍性化在植物進(jìn)化、作物品種改良上作用重大，在遺傳育種、優(yōu)良農(nóng)藝性狀利用上還將發(fā)揮越來越重要的作用。準(zhǔn)確鑒定植物倍性水平是發(fā)揮其作用的重要環(huán)節(jié)。

各種鑒定方法結(jié)合運(yùn)用，可用來判斷鑒定的準(zhǔn)確性。各種方法的綜合運(yùn)用，相互印證，才能摸索出各種植物倍性鑒定的正確方法。植物倍性化后，其遺傳行為將更為復(fù)雜，必須針對各種植物分別進(jìn)行深入研究，但各種植物倍性鑒定方法可以相互借鑒，達(dá)到快速、省時省力鑒定植物倍性的目的，更好地為倍性植物的利用服務(wù)。

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S663.1；S603.2

A

1006-9402(2016)03-0001-02

2016-04-11

作者郵箱：kfx196843@126.com