王　斌，徐綺嬪，郭慧琛，曹隨忠，孫世琪*，姚學萍 *

(1．四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,甘肅蘭州 730046)

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文獻綜述

犬細小病毒病毒樣顆粒研究進展

王斌1,2，徐綺嬪2，郭慧琛2，曹隨忠1，孫世琪2*，姚學萍1 *

(1．四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川成都 611130；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,甘肅蘭州 730046)

摘要：犬細小病毒病毒樣顆粒(VLPs)是利用表達系統(tǒng)體外表達犬細小病毒衣殼蛋白VP2后，自我組裝而成，與天然病毒具有相似的形態(tài)和空間結構，其不含有病毒的遺傳物質，且具有較好的安全性和免疫原性，能有效刺激機體產(chǎn)生良好的免疫反應。犬細小病毒病毒樣顆粒在生物醫(yī)藥領域的應用主要集中于研發(fā)病毒樣顆粒疫苗，而應用病毒樣顆粒作為生物載體亦是目前的關注熱點。此外，近年來利用不同表達系統(tǒng)表達犬細小病毒VP2蛋白后組裝獲得病毒樣顆粒的報道層出不窮?；诖耍撐木C述了犬細小病毒病毒樣顆粒的獲得及其應用研究進展，以期為相關科研工作者提供參考。

關鍵詞：犬細小病毒；病毒樣顆粒；體外組裝；生物應用;疫苗

犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是利用特定表達質粒將編碼犬細小病毒衣殼蛋白的基因轉入原核或真核細胞中進行表達，組裝獲得的高度結構化的空心顆粒。CPV VLPs形態(tài)和結構與天然病毒粒子相似，通過與病毒感染宿主細胞相似的途徑遞呈給免疫細胞(T、B淋巴細胞)，進而有效誘導機體產(chǎn)生體液和細胞免疫反應[1]。CPV VLPs因不含病毒的遺傳物質無法增殖且無致病性，對犬細小病毒病來說是一種最為理想的高效疫苗形式。它還可以作為生物載體通過化學偶聯(lián)或者通過衣殼蛋白內部電性作用攜帶非蛋白抗原[2]。迄今為止，國內外學者針對30多種感染人和動物的不同病毒已經(jīng)研究出相應的VLPs，其中幾種VLPs疫苗已商品化應用于市場[3]。對于犬細小病毒病毒樣顆粒的研究目前仍停留在衣殼蛋白的構建和表達鑒定等方面，商品化的CPV VLPs疫苗還尚未見報道。

1CPV VLPs的生物學特性

犬細小病毒可引起犬急性出血性腸炎和急性心肌炎，發(fā)病率和病死率高，對犬及狐等經(jīng)濟動物具有極大的危害。CPV是一類結構簡單的線狀單鏈DNA病毒，形態(tài)呈六角形或圓形，等軸對稱的20面體，直徑約為20 nm，衣殼蛋白無囊膜，不含脂質或糖類。CPV衣殼蛋白只含有VP1和VP2兩種蛋白，其中VP2占90%，而VP1只占10%[4-5]。成熟的病毒粒子還含有VP2的裂解產(chǎn)物VP3蛋白，它只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后才出現(xiàn)[6]。VP2是構成衣殼蛋白的主要成分，全長1755 bp, 編碼584個氨基酸，位于VP1的C端，其上的幾個關鍵堿基和氨基酸的變化將會改變病毒抗原特性和宿主范圍[7]。VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重疊，且二者終止于同一密碼子[8]。VP2是CPV的主要保護性抗原蛋白，是制備CPV基因工程疫苗的重要侯選保護性抗原[9]。利用CPV VP2蛋白獲得的病毒樣顆粒，不僅保持了CPV的免疫原性，還能夠模擬CPV自然病毒粒子感染途徑，通過VP2蛋白與細胞表面轉鐵蛋白受體特異性結合實現(xiàn)CPV VLPs的靶向定位或載運[10-12]。

2CPV病毒樣顆粒的獲得

CPV VLPs的制備通常是由表達系統(tǒng)表達衣殼蛋白VP2后體外組裝而獲得。一般常用的表達系統(tǒng)分為真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)，真核細胞表達系統(tǒng)包括昆蟲細胞表達系統(tǒng)和酵母細胞表達系統(tǒng)，而原核表達系統(tǒng)中應用較多的是大腸埃希菌表達系統(tǒng)[2]?，F(xiàn)今使用較成熟的CPV VLPs表達系統(tǒng)主要以真核表達系統(tǒng)為優(yōu)先選擇，主要原因是真核表達系統(tǒng)能夠實現(xiàn)外源蛋白翻譯后的修飾和折疊，表達的重組VP2蛋白具有天然的分子構象，利于VLPs的形成[13-14]。

2.1真核表達系統(tǒng)獲得CPV VLPs

2.1.1酵母細胞表達系統(tǒng)有研究者采用PCR方法對CPV VP2基因進行擴增，將CPV VP2基因克隆到畢赤酵母分泌的載體pPICZAA中，構建真核表達重組質粒pPICZAA-VP2，然后將該重組質粒線性化后轉化進巴斯德畢赤酵母X-33中，甲醇誘導表達CPV VP2蛋白。經(jīng)Western blot鑒定表明，重組質粒pPICZAA-VP2表達的蛋白能夠被CPV VP2單克隆抗體識別，為CPV VP2蛋白。擴大表達后選擇鎳親和層析柱分離、純化帶組氨酸標簽的CPV VP2蛋白。血凝試驗表明,純化后的CPV VP2蛋白具有血凝性。蛋白酶切除標簽，使用弗氏不完全佐劑乳化后接種小鼠，血凝抑制試驗表明,純化后的CPV VP2蛋白能夠刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應[15]。但該試驗未進行深入研究，重組畢赤酵母菌所表達的CPV VP2蛋白在體外是否能夠自組裝成VLPs,刺激有機體產(chǎn)生免疫反應的是病毒樣顆粒還是VP2蛋白等有待進一步證實。

2.1.2昆蟲細胞表達系統(tǒng)主要是利用桿狀病毒作為載體，使衣殼蛋白在昆蟲細胞內高效表達。有研究者成功構建了表達CPV VP2蛋白的重組桿狀病毒Bac-VP2表達載體。該病毒感染昆蟲細胞或家蠶后，能夠大量表達CPV VP2蛋白，電鏡檢測時觀察到直徑25 nm的球形VLPs，表明該系統(tǒng)大量表達的CPV VP2蛋白能夠自組裝成VLPs，且大小、形態(tài)與天然病毒粒子相似。隨后用蠶蛹表達的CPV VLPs分別通過肌肉注射和口服兩種方式免疫接種豚鼠，兩種免疫途徑豚鼠血清均產(chǎn)生了血凝抑制抗體[16]。Choudary P V等[17]利用蠶蛹幼蟲成功表達了CPV VLPs，接種小鼠后證實該病毒樣顆粒具有較強免疫原性。

此外，狂犬病病毒、犬瘟熱病毒和犬細小病毒嵌合體病毒樣顆粒在昆蟲細胞中進行過表達，使用該嵌合體病毒樣顆粒免疫接種小鼠，經(jīng)電子顯微鏡觀察、血凝抑制試驗及間接免疫熒光檢測，結果表明，利用昆蟲表達系統(tǒng)成功獲得的犬細小病毒嵌合體病毒樣顆粒具有高免疫原性[18]。

桿狀病毒載體具有宿主范圍窄、不感染人類、滅活簡單等優(yōu)點，同時桿狀病毒基因組能夠容納大量外源基因，可同時表達多種衣殼結構蛋白。更重要的是，昆蟲細胞表達系統(tǒng)可以對表達后的病毒結構蛋白進行修飾，如衣殼蛋白糖基化等，從而促進了VLPs的正確組裝；使用蔗糖密度梯度離心法純化昆蟲細胞表達的VLPs，因其不含有哺乳動物病原體組分，安全性好，該系統(tǒng)被廣泛應用于商品化VLPs疫苗的研制中。但是，利用昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達組裝的CPV VLPs因其使用的載體質粒含有桿狀病毒基因，純化所得蛋白內容易受到桿狀病毒污染，使其應用受到限制。

2.1.3其他真核細胞表達系統(tǒng)在過去幾十年里，以植物表達系統(tǒng)為生產(chǎn)平臺的應用體系，因快速、高擴展性和高性價比等優(yōu)點成為工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)所關注的熱點。此外，植物細胞中蛋白質翻譯后的修飾也類似于哺乳動物細胞。在植物細胞表達系統(tǒng)中，既能通過穩(wěn)定引進轉基因成核或質體基因組，又能以植物病毒載體瞬時轉化來實現(xiàn)重組蛋白在植物細胞中的表達[19-20]。

在植物細胞表達VLPs的研究領域中，進展居前的是諾瓦克病毒(Norwalk virus，NV)VLPs疫苗[21]。除此之外，利用植物細胞表達系統(tǒng)現(xiàn)已成功表達的VLPs還有艾滋病Gag蛋白疫苗、二價乙型肝炎疫苗、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)疫苗、嵌合體AIMV疫苗等。這些VLPs在靈長類動物體內均產(chǎn)生了強烈的體液免疫和細胞免疫反應[22]。目前未見利用上述表達系統(tǒng)來表達CPV VLPs的報道，其開發(fā)應用潛力有待進一步研究。

采用哺乳動物或禽類細胞系統(tǒng)生產(chǎn)的VLPs能夠對翻譯后的蛋白復合物進行糖基化修飾，其性狀和病毒自身的蛋白相似，同時又具有較好的免疫原性，然而生產(chǎn)過程的高成本和潛在的安全問題仍是一個制約性的挑戰(zhàn)。

2.2原核細胞表達系統(tǒng)獲得CPV VLPs

與真核表達系統(tǒng)相比，大腸埃希菌表達系統(tǒng)是目前公認的高效、廉價、安全性良好的原核細胞表達系統(tǒng)。利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)構建表達CPV VLPs的研究已取得初步進展。Xu J等[23]利用PCR成功擴增CPV VP2基因，將VP2基因克隆于pSMK載體中，從而獲得重組表達質粒pSMK-VP2，所構建的質粒還在VP2的N端融合表達His標簽與SUMO標簽。將該重組質粒pSMK-VP2轉化入BL21宿主菌(E.coliBL21-codon Plus (DE3)-RIL)中16℃低溫誘導表達；His標簽用于鎳親和層析柱分離、純化CPV VP2蛋白。純化的CPV VP2蛋白和SUMO蛋白酶按一定比例混合切除上述兩種標簽后，利用VP2結構蛋白自組裝的特性，使其在體外環(huán)境下形成CPV VLPs。經(jīng)透射電子顯微鏡(TEM)鑒定表明，體外環(huán)境自組裝成的CPV VLPs具有與天然病毒相似的顆粒狀結構。經(jīng)接種小鼠后淋巴細胞分類檢測結果顯示，該表達系統(tǒng)自組裝成的CPV VLPs具有免疫原性，能夠有效刺激機體產(chǎn)生良好的細胞和體液免疫反應。這是CPV VLPs在大腸埃希菌表達系統(tǒng)中成功表達的一個實例。另有部分學者以相似的研究思路，利用原核載體表達了VP2蛋白，體外酶切切除氨基酸標簽后借助VP2自組裝特性形成CPV VLPs[24]。由大腸埃希菌表達系統(tǒng)表達后自組裝產(chǎn)物CPV VLPs蛋白量較少、純度較低，其他相關研究中只是涉及到利用大腸埃希菌系統(tǒng)表達VP2蛋白，小鼠接種后探討純化VP2蛋白的免疫原性以及結合CPV抗體的特異性。而對該VP2蛋白能否形成VLPs未做深入研究[25-27]。

綜上所述，對于CPV VLPs的表達多數(shù)集中于昆蟲表達系統(tǒng)利用桿狀病毒表達了CPV VP2蛋白VLPs和在原核表達系統(tǒng)使用大腸埃希菌表達特異性CPV VLPs。預防病毒性疾病CPV VLPs亞單位疫苗被證明具有潛在的應用前景，但對于CPV VLPs表達體系的選擇和優(yōu)化還需深入的研究。

3CPV VLPs的生物學應用

3.1CPV VLPs在病毒學基礎研究中的應用

CPV VLPs的獲得主要是將CPV的VP2衣殼蛋白在相應的表達系統(tǒng)中表達后自組裝成VLPs，與天然病毒具有類似的形態(tài)結構，因此，在進行CPV入侵及出芽等方面的研究時，可以利用自組裝的CPV VLPs模擬真實病毒感染途徑用于研究CPV入侵細胞的方式及其在機體細胞中的定位。利用帶有特殊熒光標記的CPV VLPs對感染動物機體進行組織細胞熒光定位，研究天然病毒對動物體的感染途徑。Feng H等[13]分析了通過昆蟲表達系統(tǒng)表達的CPV VP2蛋白在形成VLPs時的結構特點及在體外環(huán)境下VLPs的穩(wěn)定性。結果表明，CPV VP1蛋白的缺失并不影響VLPs的形成，在一定情況下，單獨表達VP2蛋白可以自組裝成CPV VLPs，且形態(tài)上類似天然病毒[28-30]。

3.2CPV VLPs在疫苗研究中的應用

目前，VLPs已經(jīng)發(fā)展成為一種比較成熟的疫苗平臺，有著廣泛的應用。由病毒的囊膜或者衣殼蛋白組成的VLPs，經(jīng)鼻內或皮膚注射給藥，能夠刺激實驗小鼠、非靈長類或者人產(chǎn)生針對多種病原的體液和細胞免疫反應，作為在疫苗免疫的應用上具有良好的潛質[31]。

CPV VLPs空間結構與天然病毒更加接近且不含病毒遺傳物質，具有比包涵體重組蛋白更強的免疫原性，比活毒疫苗、減毒疫苗和病毒載體疫苗更安全的優(yōu)點。因此，基于VLPs平臺開發(fā)預防性和治療性疫苗無疑是最有效的疫苗策略之一。VLPs作為一種新型亞單位疫苗，無論是單一VLPs疫苗還是嵌合體VLPs疫苗，VLPs都可以作為直接免疫原，刺激機體的體液和細胞免疫應答。目前臨床應用上約有20種～30種VLPs，但應用較為成熟的只有2種VLPs，分別是利用大腸埃希菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的人源乙型肝炎病毒VLPs疫苗和人乳頭瘤病毒VLPs疫苗?，F(xiàn)階段，CPV VLPs疫苗的研發(fā)也只是停留在對實驗動物小鼠免疫評價階段，病毒原屬動物免疫學評價還未見有報道。

3.3CPV VLPs作為生物載體的應用

通常情況下，病毒結構蛋白上大多存在帶正電荷的堿性多肽域，并且這些堿性多肽域一般位于顆粒內部，所以可以與帶負電荷的核酸磷酸骨架形成一種非特異性、高親和性的相互作用力。類似地，其他帶有合適電荷的物質，都可以被包裹入VLPs球心內部或化學偶聯(lián)于其表面，因此VLPs可作為基因或藥物轉移的載體[32-33]。使用VLPs免疫，可以將VLPs作為分子載體在VLPs表面構建多個抗原決定基因，增加其免疫原性的同時，擴大VLPs的免疫效果。

Han J E等[34-35]利用猿猴病毒SV40病毒樣顆粒在體外自組裝時將量子點包被其中，通過光譜特性分析發(fā)現(xiàn)，SV40病毒樣顆粒嵌合體(VLP-QD)具有良好的穩(wěn)定性。在活細胞刺激培養(yǎng)時， SVLP-QD是以胞膜內吞作用進入細胞內部，沿微管積聚在內質網(wǎng)；此方式類似天然病毒感染細胞的途徑。利用病毒樣顆粒包被具有熒光特性的量子點或磁性納米粒子，在動物體內作為檢測病毒的熒光標記物或粒子靶向給藥的載體，在一個直接可見的方式下研究病原體對宿主的致病性機制。此外，SVLP-QD可進一步發(fā)展為多功能納米粒子用于體內腫瘤的診斷、定位、檢測治療等類似應用。

4CPV VLPs應用前景展望

CPV VLPs是由病毒VP2蛋白自組裝成的空心顆粒，因其不含病毒的遺傳物質，無法復制和增殖，而不具備感染致病的能力，安全性遠高于傳統(tǒng)的滅活疫苗和活病毒疫苗[2]。利用不同表達系統(tǒng)生產(chǎn)的CPV VLPs具有接近天然病毒粒子的空間構象和抗原表位展示，在通常情況下能夠刺激機體產(chǎn)生高效、持久的全身性免疫反應，有望成為一種新型的CPV疫苗[1]。但是，CPV VLPs的生產(chǎn)尚存在一些技術難題，例如各種表達系統(tǒng)下生產(chǎn)出的VLPs流程較復雜，最后得率較低，阻礙了VLPs從實驗室到臨床上的轉化。在CPV VLPs形成過程中，其實就是衣殼蛋白聚集和自組裝之間相互競爭的過程。溫度、離子強度、pH都容易影響VLPs的自組裝，組裝過程中小部分蛋白聚集就能嚴重影響VLPs的產(chǎn)量和均一性。影響VLPs疫苗發(fā)揮作用的主要因素在于它能夠很好的保持三維構象，從而具有與天然病毒十分相似的抗原表位。VLPs形成過程對外界環(huán)境比較敏感，外部環(huán)境變化較大，就會影響VLPs疫苗的效價。這就需要探尋不同表達系統(tǒng)下CPV VLPs組裝過程中主要的影響因素，最大可能地減少聚集的發(fā)生。

已有研究表明,不同表達系統(tǒng)下獲得的CPV VLPs在免疫動物后取得了較好的免疫效果，雖然目前疾病預防還主要依靠滅活苗和弱毒苗，但是病毒樣顆粒疫苗以它獨具的優(yōu)勢，展現(xiàn)出良好的應用前景，但對于CPV VLPs表達體系的選擇和優(yōu)化以及佐劑的劑量仍需深入研究。此外，利用CPV VLPs生物載體的特性，通過化學偶聯(lián)或者生物蛋白包被的方式結合不同形式的載運體，包括抗性基因、抗癌藥物、納米顆粒、熒光量子點等，期望能夠在研究生物靶向藥物治療和生物成像方面為CPV VLPs更廣泛的生物應用擴展思路。

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Progress on Virus-like Particles of Canine Parvovirus

WANG Bin1,2, XU Qi-pin2,GUO Hui-chen2,CAO Sui-zhong1,SUN Shi-qi2,YAO Xue-ping1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgricultureUniversity,Chengdu,Sichuan,611130,China;2.KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince,StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,CAAS,Lanzhou,Gansu,730046,China)

Abstract:The virus-like particles(VLP) of canine parvovirus are self-assembled by capsid protein VP2 of canine parvovirus(CPV).It possesses the similar morphology and spatial structure with the natural virus.CPV VLPs do not contain any genetic materials of CPV ensuring that they get better immunogenicity and safety.It could simulate the body to generate immunoreaction well.In recent years,there have been lots of reports that the CPV VP2 has been used to construct VLPs by self-assembly.The applications of CPV VLPs now mainly focus on the vaccine research.This review summarized the production of the CPV VLPs and their applications expecting to provide references for researchers.

Key words:Canine parvovirus(CPV);virus-like particles; in-vitro Assembly;biological application;vaccine

文章編號:1007-5038(2016)03-0081-05

中圖分類號:S852.659.2;Q789

文獻標識碼:A

作者簡介：王斌(1989-)，男，寧夏石嘴山人，碩士研究生,主要從事犬細小病毒樣顆粒的研究。*通訊作者

基金項目：國家國際科技合作專項( 2014DFA31890)；國家科技支撐計劃項目 (2013BAD12B00)；“十二五”農(nóng)村領域國家科技計劃項目(2011AA10A211)；甘肅省國際科技合作項目(1104WCGA185)

收稿日期：2015-08-29