韓　慧,黃福達(dá),張秀明,吳炳義

(1.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院/中山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528403；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，廣州 510515)

?

·論著·

TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)新型隱球菌方法的建立

韓慧1,黃福達(dá)1,張秀明1,吳炳義2△

(1.中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院/中山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528403；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，廣州 510515)

目的建立TaqMan熒光定量PCR方法定量檢測(cè)新型隱球菌基因組DNA，為檢測(cè)隱球菌性腦膜炎提供重要方法。方法在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)查找新型隱球菌各亞型的ITS-rDNA序列，序列比對(duì)后設(shè)計(jì)特異性引物和探針，擴(kuò)增片段為114 bp，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，調(diào)整質(zhì)粒濃度為1.42×108copy/μL ～ 1.42×10 copy/μL共8個(gè)濃度梯度，分別取2 μL作為模板，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行敏感性、特異性、重復(fù)性評(píng)價(jià)，并檢測(cè)臨床確診的15例隱球菌腦膜炎感染菌株。結(jié)果建立的熒光定量PCR可以檢測(cè)2.84×102拷貝的質(zhì)粒DNA，對(duì)臨床分離的各10例其他真菌、細(xì)菌、乙型肝炎病毒DNA和人類基因組DNA均無(wú)擴(kuò)增曲線，重復(fù)性良好，3個(gè)濃度的批間變異系數(shù)分別為2.86%、1.48%、1.36%，可準(zhǔn)確檢測(cè)15例新型隱球菌。結(jié)論成功建立檢測(cè)新型隱球菌的熒光定量PCR方法，敏感性和特異性較高，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可早期、快速診斷隱球菌性腦膜炎。

熒光定量PCR；新型隱球菌；基因組DNA

新型隱球菌是一種條件致病菌，主要通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺部，引起炎性或隱性感染。機(jī)體免疫功能降低，侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致隱球菌性腦膜炎。由于該病早期無(wú)明顯癥狀和體征，腦脊液變化不典型，很難與其他疾病相鑒別，易被誤診而延誤治療。新型隱球菌腦膜炎的確診主要依據(jù)腦脊液墨汁染色檢測(cè)新型隱球菌，但早期涂片染色陽(yáng)性率低，因此建立一種早期、快速診斷隱球菌的方法至關(guān)重要[1-3]。

1　材料與方法

1.1一般材料新型隱球菌菌株來(lái)自廣州市微生物研究所和檢驗(yàn)科臨床分離的菌株，腦膜炎雙球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、黃曲霉、黑曲霉各10例及乙型肝炎病毒DNA和人類基因組DNA各2例作為陰性對(duì)照(檢驗(yàn)科)。酵母基因組DNA提取試劑盒(北京天根)，溶壁酶(東盛生物)，Premix Ex TaqTM和pMD20-T載體購(gòu)自TAKARA，熒光定量PCR儀器為Stratagene MX3005P。

1.2引物和探針在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)查找新型隱球菌各亞型的ITS-rDNA序列，比對(duì)后找出其共同的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，探針5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，序列上游引物：5′-GTT GGA CTT GGA TTT GGG TGT T-3′ ；下游引物：5′-GGC CCA GCG AAA CTT ATT ACG-3′ 。TaqMan探針：5′-FAM-CGA CCT GCA AAG GAC GTC GGC TC-T AMR A-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為114 bp。引物和探針由上海生工合成。

1.3DNA提取和質(zhì)粒構(gòu)建新型隱球菌株及隱球菌感染的腦脊液標(biāo)本接種在沙保羅液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取2 mL離心留沉淀，使用溶壁酶和基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用上、下游引物擴(kuò)增DNA模板，應(yīng)用PCR產(chǎn)物，按照pMD20-T載體試劑盒說(shuō)明，連接后轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂板，篩選陽(yáng)性克隆，華大生物公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序鑒定為目的質(zhì)粒。使用核酸測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)，運(yùn)用無(wú)菌去離子水進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無(wú)菌去離子水為空白對(duì)照，以2.84×108～2.84×102拷貝作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4熒光定量PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系為25 μL，Premix 12.5 μL，上、下游引物(終濃度10 μmol/L)各0.5 μL，探針(終濃度10 μmol/L)為1 μL，內(nèi)參染料ROX 0.5 μL，模板2 μL，去離子水補(bǔ)足至25 μL，同時(shí)做空白對(duì)照。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和敏感性將構(gòu)建的新型隱球菌質(zhì)粒定量后，進(jìn)行10倍的梯度稀釋，調(diào)整濃度為1.42×108copy/μL～1.42×10 copy/μL，分別取2 μL作為模板，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，按照上述建立的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后以最低檢測(cè)濃度值作為檢測(cè)敏感性，同時(shí)儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6熒光定量PCR特異性按上述反應(yīng)條件同時(shí)檢測(cè)腦膜炎雙球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、黃曲霉、黑曲霉等DNA，檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA和人類基因組DNA，觀察擴(kuò)增結(jié)果。提取15例隱球菌患者腦膜炎的腦脊液標(biāo)本DNA，使用上述引物和探針進(jìn)行檢測(cè)。

1.7熒光定量PCR重復(fù)性選取1.42×107、1.42×105、1.42×103copy/μL 3個(gè)濃度為模板，每天進(jìn)行1次實(shí)驗(yàn)，每次每個(gè)梯度做3次重復(fù)，連續(xù)檢測(cè)3 d，使用同一臺(tái)PCR儀器，根據(jù)CT值計(jì)算CV值，觀察重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2　結(jié)　　果

2.1熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建新型隱球菌質(zhì)粒測(cè)序圖及對(duì)比結(jié)果，以每個(gè)反應(yīng)濃度2.84×108～2.84×102拷貝制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增曲線良好，各濃度與CT值之間呈很好的負(fù)相關(guān)關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-3.354log(X)+45.73，相關(guān)系數(shù)為0.998，說(shuō)明具有很好的線性關(guān)系。

2.2熒光定量PCR的敏感性調(diào)整質(zhì)粒的濃度為1.42×108copy/μL～ 1.42×100copy/μL，分別取2 μL作為模板，在2.84×108～2.84×102拷貝濃度范圍內(nèi)，起始模板的濃度與CT值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系和線性關(guān)系，因此敏感性為2.84×102拷貝的質(zhì)粒DNA。

2.3熒光定量PCR的特異性應(yīng)用建立的PCR方法擴(kuò)增腦膜炎雙球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌、黃曲霉、黑曲霉、乙型肝炎病毒DNA和人類基因組DNA，結(jié)果顯示均無(wú)任何擴(kuò)增曲線，說(shuō)明特異性良好。檢測(cè)腦脊液提取的DNA，提示均有較好的擴(kuò)增曲線，表明設(shè)計(jì)的引物和探針可準(zhǔn)確檢測(cè)新型隱球菌致病菌株。

2.4熒光定量PCR的重復(fù)性選取3個(gè)濃度進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)3 d檢測(cè)3次，每次均做3個(gè)重復(fù)，2.84×107拷貝的CT值為(20.99±0.60)，CV值為2.86%，2.84×105拷貝CT值為(28.32±0.42)，CV值為1.48%，2.84×103拷貝CT值為(34.38±0.47)，CV值為1.36%，3個(gè)濃度的批間CV值均小于5%，說(shuō)明重復(fù)性和穩(wěn)定性優(yōu)良。

3　討　　論

近年來(lái)，由于抗菌藥物和免疫抑制劑的大量應(yīng)用，腦膜炎的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，特別是病死率高的隱球菌性腦膜炎，其病情較嚴(yán)重，但早期臨床表現(xiàn)、生化指標(biāo)缺乏特異性，與結(jié)核性腦膜炎、病毒性腦膜炎臨床表現(xiàn)相似，易誤診，且晚期缺乏有效的治療藥物，致殘率和病死率極高[4]。目前墨汁染色顯微鏡檢查和腦脊液培養(yǎng)仍是隱球菌腦膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)際應(yīng)用中陽(yáng)性率低，敏感性和特異性差、耗時(shí)長(zhǎng)，且應(yīng)進(jìn)行抗菌藥物治療的患者不易檢出陽(yáng)性結(jié)果，而腦膜炎患者的治療效果和預(yù)后，與其能否早期診斷和合理治療密切相關(guān)。

以PCR為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增技術(shù)已逐漸應(yīng)用于臨床，成為實(shí)驗(yàn)室快速診斷方法，其已廣泛應(yīng)用于真菌性疾病的診斷[5-7]，也逐漸應(yīng)用于隱球菌感染的診斷[8-9]。該方法敏感性高、特異性強(qiáng)，可以早期從少量標(biāo)本中檢出病原菌，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，可快速、可靠、高敏感性和高特異性地診斷感染性疾病[10-11]。

本研究采用熒光定量PCR探針?lè)?，通過(guò)比對(duì)各亞型的ITS-rDNA序列，依據(jù)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，該方法較普通PCR操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，無(wú)需后續(xù)的電泳，極大地減少了反應(yīng)產(chǎn)物的污染，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程2 h內(nèi)即可完成。特異性強(qiáng)，與其他真菌、細(xì)菌、病毒和人類基因組DNA均無(wú)交叉反應(yīng)。敏感性高，最低可檢測(cè)284個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA，根據(jù)擴(kuò)增曲線和CT值觀察結(jié)果，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量起始模板量。使用該方法檢測(cè)5例腦脊液分離菌株，均有明顯的擴(kuò)增曲線，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物和探針能準(zhǔn)確應(yīng)用于臨床標(biāo)本檢測(cè)。在今后的研究工作中，應(yīng)檢測(cè)更多的腦脊液標(biāo)本以評(píng)價(jià)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究建立的TaqMan探針?lè)晒舛縋CR檢測(cè)新型隱球菌基因組DNA，具有良好的敏感性、特異性、重復(fù)性，可早期準(zhǔn)確地診斷隱球菌性腦膜炎，為臨床診斷和治療提供重要的依據(jù)。

[1]王志嬌，肖農(nóng)．兒童新型隱球菌腦膜炎17例臨床分析[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2008，37(24)：2824-2825．

[2]Mccann S,Byrne JL,Rovira M,et al.Outbreaks of infectious diseases in stem cell transplant units:a silent cause of death for patients and transplant programmes[J].Bone Marrow Transplant,2004,33(5):519-529.

[3]Gago S,Esteban C,Valero C,et al.A multiplex real-time PCR assay for identification of Pneumocystis jirovecii,Histoplasma capsulatum,and Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii in samples from AIDS patients with opportunistic pneumonia[J].J Clin Microbiol,2014,52(4):1168-1176.

[4]張志，黃宗青，沈琪，等．新型隱球菌性腦膜炎分子診斷方法的建立[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30(10)：1185-1187．

[5]Ferrer C,Colom F,Frasés S,et al.Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S ribosomal DNA typing in ocular infections[J].J Clin Microbiol,2001,39(8):2873-2879.

[6]Itahashi M,Higaki S,Fukuda M,et al.Detection and quantification of pathogenic bacteria and fungi using real-time polymerase chain reaction by cycling probe in patients with corneal ulcer[J].Arch Ophthalmol,2010,128(5):535-540.

[7]張偉錚，肖倩，屈平華，等．ITS基因序列分析在鑒定暗色真菌中的應(yīng)用[J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30(15)：2493-2496．

[8]TavaresER,AzevedoCS,PanagioLA,etal.Accurateandsensitivereal-timePCRassaysusingintergenicspacer1regiontodifferentiateCryptococcusgattiisensulatoandCryptococcusneoformanssensulato[J].Med Mycol,2016,54(1):89-96.

[9]韓慧，胡子有，吳炳義．熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)隱球菌CAP10基因的比較研究[J]．南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32(6)：817-820．

[10]Susever S,Yeenolu Y.Evaluation of the significance of molecular methods in the diagnosis of invasive fungal infections:comparison with conventional methods[J].Mikrobiyol Bul,2011,45(2):325-335.

[11]Han H,Hu Z,Sun S,et al.Simultaneous detection and identification of bacteria and fungi in cerebrospinal fluid by TaqMan probe-based real-time PCR[J].Clin Lab,2014,60(8):1287-1293.

Establishment of TaqMan probe real-time PCR for detection of Cryptococcus neoformans

HANHui1,HUANGFuda1,ZHANGXiuming1,WUBingyi2△

(1.CenterofLaboratoryMedicine,ZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China;2.ResearchCenterofClinicalMedicine,NanfangHospitalAffiliatedofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

ObjectiveTo establish TaqMan probe real-time Fluorescent Quantitative PCR in detecting Cryptococcus neoformans genomic DNA,and to provide important method for detection of cryptococcal meningitis.MethodsAccording to the Cryptococcus neoformans ITS-rDNA sequences obtained from NCBI,specific primers and probe were designed based on the conserved sequences,a specific 114 bp fragment was amplified by primers and probe,then recombinant plasmid was constructed.Eight different concentrations from 1.42×10 copy/μL to 1.42×10 copy/μL were used as templates by 2 μL.In the optimum reaction condition,the sensitivity，specificity and repeatability were evaluated and standard curve was established.15 clinical cryptococcal meningitis strains isolated from clinical diagnosis patients were detected.ResultsThe real-time PCR showed high sensitivity and specificity and was able to detect 2.84×102copies of plasmid DNA.The detection sensitivity was 2.84×102copies plasmid DNA by real-time PCR,no amplification curve was detected with human genomic DNA,other fungus,bacterias and viruses.TheCVof inter-assay were 2.86%，1.48% and 1.36% respectively with excellent reproducibility.Fifteen clinical isolated strains could be detected accurately.ConclusionA method of detection of Cryptococcus neoformans DNA by real-time PCR is established successfully with high sensitivity and specificity,and the results are stable,could diagnose cryptococcal meningitis rapidly and early.

real-time PCR;Cryptococcus neoformans; genomic DNA

韓慧，女，主管技師，主要從事臨床血液研究。

，Email:wubingyi66@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.015

A

1673-4130(2016)19-2697-03

2016-02-13

2016-04-24)