董雪梅，賀　銳，章國(guó)平，蒲巍林 綜述,杜曉鐘 審校

(甘肅省婦幼保健院， 蘭州 730050)

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·綜述·

端粒酶分析方法的研究進(jìn)展*

董雪梅，賀銳，章國(guó)平，蒲巍林 綜述,杜曉鐘△審校

(甘肅省婦幼保健院， 蘭州 730050)

端粒；端粒酶；端粒酶活性；測(cè)定方法

端粒和端粒酶是近年來(lái)生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,其在腫瘤臨床檢測(cè)與治療中已得到廣泛研究，但在生殖領(lǐng)域尚屬起步階段。人端粒酶活性(TA)是精子發(fā)生高度敏感性和特異性的標(biāo)志物，生殖細(xì)胞中端粒酶的檢測(cè)特別是對(duì)原發(fā)性無(wú)精子癥患者睪丸灶性精子發(fā)生的診斷具有重要的臨床意義[1]。

1　TA檢測(cè)的研究進(jìn)展

TA的早期檢測(cè)是Morin[2]建立的端粒重復(fù)序列延伸法，即利用端粒酶自身反轉(zhuǎn)錄合成端粒末端片斷的特性進(jìn)行端粒合成,然后通過(guò)加入Rnase破壞端粒模板，采用12%聚丙烯酰胺電泳分離，放射顯影可見(jiàn)陽(yáng)性條帶。該方法穩(wěn)定性較好，但所需標(biāo)本量大，敏感性差，實(shí)驗(yàn)復(fù)雜,所需時(shí)間長(zhǎng)。

Kim等[3]建立端粒重復(fù)擴(kuò)增法(TRAP)，該法將端粒酶的反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)大量擴(kuò)增，使測(cè)定的敏感性提高了約10 000倍，是近年來(lái)被全世界普遍采用的方法，但該法需將擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行放射顯影，因使用放射性同位素標(biāo)記，易有放射性污染且價(jià)格昂貴，方法十分繁雜，臨床推廣應(yīng)用受到一定限制。

1996年德國(guó)Boehringer公司用標(biāo)記地高辛探針檢測(cè)端粒酶擴(kuò)增產(chǎn)物，推出端粒酶-ELISA檢測(cè)試劑盒，該法極大簡(jiǎn)化了PCR產(chǎn)物檢測(cè)操作步驟，4 h內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果，但試劑盒不同批號(hào)間常出現(xiàn)較大差異，且試劑價(jià)格極為昂貴，臨床無(wú)法常規(guī)應(yīng)用。雖現(xiàn)已有公司提供地高辛標(biāo)記的引物，但該試劑是否穩(wěn)定，尚待進(jìn)一步探討。

2　TA的改進(jìn)檢測(cè)技術(shù)

目前研究TA定量檢測(cè)方法是為了減少繁鎖費(fèi)時(shí)的PCR檢測(cè)步驟，改進(jìn)循環(huán)條件，提高敏感性和線性。端粒酶表達(dá)常見(jiàn)方法有電泳法和酶免法。

2.1改良端粒重復(fù)序列擴(kuò)增(TRAP)-銀染法利用端粒酶在體外的RNA模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6 個(gè)堿基的重復(fù)序列特性，采用PCR 方法擴(kuò)增此重復(fù)序列，并進(jìn)而用聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示6 個(gè)堿基差異的梯帶。根據(jù)Kim等[3]的端粒重復(fù)片段擴(kuò)增方法，首先合成1個(gè)18 nt 的TS 做上游引物，端粒酶結(jié)合TS 末端的GTT 并合成AGGGTTAG，然后每經(jīng)過(guò)1次轉(zhuǎn)位合成1個(gè)GGTTAG的6核堿基重復(fù)序列，端粒酶滅活后，加入CX 做下游引物，經(jīng)過(guò)多次變性-退火-延伸，擴(kuò)增端粒酶延伸產(chǎn)物。陽(yáng)性結(jié)果在凝膠電泳上顯示相隔6 bp 的梯狀條帶，條帶的多、寡、深或淺表示TA大小。采用銀染方法用于TRAP-PCR標(biāo)記染色，既解決了同位素的放射性污染問(wèn)題，又簡(jiǎn)便、安全、省時(shí)，敏感性較溴化乙錠染色高5～10倍[4]。另外，硝酸銀染色僅在可見(jiàn)光下即可觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可經(jīng)凝膠干燥后長(zhǎng)期保存。因此，該方法有望成為生殖細(xì)胞TA檢測(cè)及惡性實(shí)體瘤早期診斷、高?；颊吆Y選及微轉(zhuǎn)移癌灶的追蹤等新的分子生物學(xué)方法。

2.2聚合酶鏈反應(yīng)-酶免法(PCR-ELISA)檢測(cè)原理為端粒酶自帶模板將端粒重復(fù)片段(TTAGGG)加到生物素標(biāo)記、人工合成的P1-TS-引物的3′端，經(jīng)PCR反復(fù)擴(kuò)增P1-TS和P2引物間的特異產(chǎn)物，產(chǎn)生含有端粒酶特異的6核苷酸重復(fù)序列的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物變性后，與地高辛標(biāo)記，并對(duì)端粒重復(fù)片段特異的探針雜交，雜交產(chǎn)物通過(guò)生物素標(biāo)記的引物固定在抗菌藥物蛋白包被的微孔板上。然后采用與過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗地高辛抗體(Anti-DIG-POD)檢測(cè)經(jīng)固定的PCR產(chǎn)物。最后加入過(guò)氧化物酶的反應(yīng)底物TMB，便可產(chǎn)生一著色反應(yīng)產(chǎn)物，測(cè)定450 nm和690 nm的吸光度(A)值。根據(jù)公式A=A450-A690。

端粒酶PCR-ELISA方法簡(jiǎn)單、方便、敏感，PCR擴(kuò)增以后，通過(guò)特異性探針與PCR變性產(chǎn)物雜交而檢測(cè)，特異性強(qiáng)，可以避免PCR反應(yīng)后的假陽(yáng)性和假陰性，且易于定量，是檢測(cè)TA較理想的方法，將有更廣泛的臨床應(yīng)用前景。

2.3熒光素-抗熒光素系統(tǒng)檢測(cè)法由于熒光素標(biāo)記引物較為簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，用熒光素-抗熒光素系統(tǒng)代替地高辛-抗地高辛耦聯(lián)法，效果良好。該法有較好的敏感性與重復(fù)性，較銀染法更為簡(jiǎn)便快速，無(wú)同位素污染，檢測(cè)成本低，有較好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

2.4端粒酶相關(guān)功能蛋白的檢測(cè)目前研究發(fā)現(xiàn)TA至少受端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(TP1/TLP1)及端粒酶催化亞單位(hTERT)的影響。hTR 是合成端粒DNA的模板，提供模板合成端粒重復(fù)序列。端粒酶在其3′端生成451個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反轉(zhuǎn)錄是在5′末端46～53個(gè)核苷酸處發(fā)生，該反應(yīng)靠近端粒DNA序列。分析hTR的2級(jí)結(jié)構(gòu)，可預(yù)測(cè)TA。目前用以預(yù)測(cè)hTR的2級(jí)結(jié)構(gòu)的方法是研究hTR的4個(gè)構(gòu)成組件，包括 CR2/CR3結(jié)構(gòu)域,aCR4/CR5 結(jié)構(gòu)域, H/ACA (CR6/CR8)盒,CR7 結(jié)構(gòu)域[5]。TP1/TLP1的功能尚未闡明，可能不僅是結(jié)構(gòu)蛋白，還是一種調(diào)節(jié)端粒酶與其他分子相互作用的調(diào)節(jié)亞單位。hTERT是TA調(diào)節(jié)的主要部分，對(duì)TA表達(dá)及維持端粒長(zhǎng)度起決定性作用。有學(xué)者使用TaqMan熒光檢測(cè)系統(tǒng)建立了實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)hTERT相關(guān)基因表達(dá)。

2.5TA相關(guān)調(diào)節(jié)因子檢測(cè)TA在人體細(xì)胞受到嚴(yán)格的調(diào)控，這個(gè)調(diào)控過(guò)程涉及一些蛋白激酶，如hTERT基因在體外磷酸化的蛋白激酶AKT，被確定為TA負(fù)調(diào)節(jié)的蛋白激酶c-ABL。蛋白激酶C家族的成員是端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶在體外磷酸化，導(dǎo)致TA，刺激hTERT啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵酶。激酶SRC作為TA的負(fù)調(diào)節(jié)，負(fù)責(zé)hTERT在氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中的磷酸化反應(yīng)。其他幾個(gè)激酶(如ERK1/2和JNK)也被認(rèn)為負(fù)責(zé)TA調(diào)控，但其作用機(jī)制尚不清楚[6-9]。

3　結(jié)　　語(yǔ)

近年來(lái)，有關(guān)端粒酶的研究異常活躍，絕大多數(shù)生物細(xì)胞DNA的端粒隨著細(xì)胞分裂而縮短，當(dāng)縮短到一定長(zhǎng)度，即達(dá)到危機(jī)點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞不再分裂而衰老、死亡,少數(shù)細(xì)胞逃逸危機(jī)點(diǎn)，激活端粒酶，從而永生或惡變[10]。正常機(jī)體細(xì)胞中TA不表達(dá)，而在干細(xì)胞、生殖細(xì)胞和90%的惡性腫瘤細(xì)胞中卻特異性地表達(dá)[11-13]。隨著對(duì)端粒酶結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控的深入研究，其在細(xì)胞永生化及癌變中的作用也有了新的認(rèn)識(shí)，生殖細(xì)胞中可檢測(cè)到TA，端粒酶在人類生殖發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，可通過(guò)端粒酶的研究來(lái)探索影響人類生殖能力的相關(guān)因素及機(jī)制，以期對(duì)人類生殖功能、胚胎質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。有研究表明，端粒酶RNA基因在男性不育癥患者睪丸組織中的表達(dá)與生殖細(xì)胞的分布定位一致，在精細(xì)胞不發(fā)育患者睪丸組織中無(wú)端粒酶RNA基因的表達(dá)，提示TA的缺乏可能是生殖細(xì)胞發(fā)育停滯的原因之一[14]。

目前，端粒酶分析方法尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，隨著端粒酶檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，可制訂TA定性及定量的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方法，從而研究端粒酶的表達(dá)在相關(guān)疾病監(jiān)測(cè)、療效和預(yù)后判斷中的作用。深入研究端粒酶在男性生殖生理及病理學(xué)意義，探討激素及其他藥物治療的端粒酶機(jī)制，使端粒酶技術(shù)成為診斷及治療男性生殖疾病的重要手段之一。

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甘肅省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZS031-A25-065-E)。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.032

A

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2016-02-18

2016-06-13)