王利勇

哈藥集團(tuán)制藥總廠質(zhì)量檢驗中心 黑龍江哈爾濱 150000

分析反相高效液相色譜法測定注射用苯唑西林鈉的有關(guān)物質(zhì)

王利勇

哈藥集團(tuán)制藥總廠質(zhì)量檢驗中心 黑龍江哈爾濱 150000

醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，各類色譜技術(shù)不斷完善，反相高效液相色譜法具有良好的選擇性和穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用，本文將利用反相高效液相色譜法對苯唑西林鈉有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測定。

反相高效液相色譜法；苯唑西林鈉；有關(guān)物質(zhì)

一、反相高效液相色譜簡介

反相高效液相色譜在液液色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，是化學(xué)鍵合相色譜的一種，它的產(chǎn)生是為了防止固體液在分離過程中流失。由于其良好的選擇性，在眾多新色譜技術(shù)中脫穎而出，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，應(yīng)用前景廣闊。其中鍵合相色譜法是通過將固定相共價結(jié)合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機(jī)械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質(zhì)逐漸改變等缺點?；瘜W(xué)鍵合固定相具有良好的穩(wěn)定性和選擇性，其制備的色譜柱具有使用壽命長，重現(xiàn)性好的特點，被廣泛應(yīng)用。

二、苯唑西林鈉簡介

苯唑西林鈉為半合成的耐酸、耐酶的異唑類青霉素。它是白色粉末或結(jié)晶性粉末；無臭或微臭。在水中易溶，在丙酮或丁醇中極微溶解，在醋酸乙酯或石油醚中幾乎不溶。2%水溶液的pH值為 5.0-7.0，不受青霉素酶水解，對產(chǎn)酶金黃色葡萄球菌菌株有效，MIC為0.4μg/mL。同其他β-內(nèi)酰胺類抗生素一樣，與氨基糖苷類抗生素混合后，可明顯減弱兩者的抗菌活性。苯唑西林鈉及其制劑的有關(guān)物質(zhì)測定，國內(nèi)外的研究資料較少，中國藥典2010年版二部采用相對保留時間對其中的特殊雜質(zhì)進(jìn)行定位，但誤差較大，加之色譜系統(tǒng)的耐用性差，導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。

三、測定前的準(zhǔn)備工作

由于苯唑西林鈉容易受到酸、堿、氧化、光照、溫度的影響，所以應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定進(jìn)行正確儲藏并注意保質(zhì)期。備齊以下測定所需用品：注射用苯唑西林鈉、乙腈、醋酸銨、醋酸、2695 Aliance高效液相色譜儀（美國 Waters公司，主要配備四元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）、電子天平、實驗室制備的超純水。

四、方法與結(jié)果

1、色譜條件

色譜柱：Thermo gold C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.01 mol·L-1醋酸銨溶液（醋酸調(diào)pH至5.0）-乙腈（75∶25）；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；檢測波長：225nm。

2、檢測波長的選擇

準(zhǔn)確稱取注射用苯唑西林鈉，制成1 mg·mL-1的溶液，用二極管陣列檢測器在400—200nm處掃描，發(fā)現(xiàn)苯唑西林鈉和其主要雜質(zhì)均在在 225nm附近波長有最大吸收，可以確定 225nm是有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。

3、色譜條件的選擇與優(yōu)化

（1）溶液的制備

稱取25.16 mg的注射用苯唑西林鈉，放置在25 mL量瓶中稀釋。

（2）流動相pH值的確定

用醋酸和三乙胺調(diào)節(jié)不同pH值的流動相進(jìn)行試驗，結(jié)果表明在pH值為5.0時，峰的對稱性最好。

（3）緩沖鹽濃度的確定

配制不同濃度的醋酸銨溶液作為流動相的水相進(jìn)行試驗，結(jié)果表明在濃度為0.01 mol· L-1時，雜質(zhì)的分離度與對稱性最好。

4、方法的專屬性考察

（1）酸破壞

稱取注射用苯唑西林鈉約25 mg，置于25 mL量瓶中，加1 mol·L-1鹽酸10 mL溶解后，放置1 h，調(diào)節(jié)pH值至7.0，再加流動相稀釋至刻度。

（2）堿破壞

取25 mL 量瓶，將25mg注射用苯唑西林鈉放入，加入2 mL L-1氫氧化鈉溶液溶解，放置三分鐘后，將PH值調(diào)節(jié)為7.0，加流動相稀釋至刻度。

（3）氧化破壞

取25 mL 量瓶，將25mg注射用苯唑西林鈉放入，加入2 mL 3%過氧化氫溶液溶解，放置兩小時后，將PH值調(diào)節(jié)為7.0，加流動相稀釋至刻度。

（4）熱破壞

稱取注射用苯唑西林鈉約 25 mg ， 置于25 mL 量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度， 70 ℃水浴中加熱2 h，放冷至室溫。

（5）光照破壞

稱取注射用苯唑西林鈉約25 mg，置于25 mL量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，用3 000～4000Lx光照射10d。取上述溶液各10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明各個峰之間均能較好地分離。

5、線性關(guān)系

精密稱取注射用苯唑西林鈉58.57 mg置50 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2.5 mL置100mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、2、4、6、10、12和24 mL各置25 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以供試液濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：A =5.238 ×104C+4.182 ×103，r =0.999 8，表明苯唑西林鈉濃度在1.171～28.11μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

6、檢測限和定量限

精密稱取注射用苯唑西林鈉適量，用流動相適量使溶解后，進(jìn)一步稀釋成不同濃度的2份，1份用流動相稀釋成最終濃度含苯唑西林鈉為0.036μg·mL-1、另1份稀釋成最終濃度含苯唑西林鈉為0.36μg·mL-1的系列溶液，分別取該兩系列溶液按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，并對色譜系統(tǒng)進(jìn)行基線檢測，結(jié)果苯唑西林鈉檢測限濃度為0.036μg·mL-1（S/ N =3），定量限濃度為0.18μg·mL-1（S/ N =10）。

7、重復(fù)性試驗

精密稱取注射用苯唑西林鈉約25mg，共6份，分別置25mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以苯唑西林鈉濃度與峰面積的比值計算，RSD為0.27%（n=6），表明重復(fù)性良好。

8、精密度試驗

精密稱取注射用苯唑西林鈉約25 mg，置25 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)6次，分別記錄色譜圖，以苯唑西林鈉濃度與峰面積的比值計算，RSD為0.12%（n=6），表明精密度良好。

9、耐用性試驗

分別用Therom gold C18（4.6 mm ×250 mm，5μm）、Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）及依利特C18（4.6 mm×200 mm，5μm）3種色譜柱對注射用苯唑西林鈉中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測定，記錄的色譜圖峰形均良好，理論板數(shù)按苯唑西林鈉峰計均為＞3000，苯唑西林鈉峰與相鄰的峰的分離度均＞1.5，耐用性好。

10、樣品測定

精密稱取注射用苯唑西林鈉約25 mg，置25 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為對照溶液。按上述色譜條件分別精密量取10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。最大單個雜質(zhì)為0.2%，總雜質(zhì)為1.0%。

總結(jié)：通過反相高效液相色譜法對注射用苯唑西林鈉的檢測發(fā)現(xiàn)，在本色譜的條件下能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離，雜質(zhì)相對的檢出率較高，表明反相高效液相色譜法具有基線穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，分析速度快、準(zhǔn)確度高的特點，并可同時測定有關(guān)物質(zhì)的含量及特點，在天然藥物、復(fù)方成藥、抗生素等藥物的分析方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。

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1672-5018（2016）10-266-02