程世亮，劉新風(fēng)，鄭　文 ，黃藝丹 ，張　君 ，鄭　建*

(1．山東省交通醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東濟(jì)南 250101；2. 奧創(chuàng)生物技術(shù)(山東)有限公司,山東濟(jì)南 250101)

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專論與講座

魚類無乳鏈球菌病

程世亮1，劉新風(fēng)1，鄭文1，黃藝丹2，張君2，鄭建2*

(1．山東省交通醫(yī)院檢驗(yàn)科,山東濟(jì)南 250101；2. 奧創(chuàng)生物技術(shù)(山東)有限公司,山東濟(jì)南 250101)

摘要：無乳鏈球菌亦稱為B組鏈球菌，是一種在自然界廣泛存在的革蘭陽性菌, 是人類的重要病原之一, 也是魚類的重要病原菌。近年來，無乳鏈球菌成為魚類鏈球菌病的主要病原之一，魚類感染無乳鏈球菌的常見臨床癥狀包括眼球突出、腹部腫脹、脊骨彎曲、鰭條基部出血等,發(fā)病率和死亡率高，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，危害著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。論文對魚類無乳鏈球菌病的研究進(jìn)行了總結(jié)，對魚類無乳鏈球菌病病原、致病機(jī)理進(jìn)行綜述，介紹了魚類無乳鏈球菌病常見的診斷方法，以及現(xiàn)階段針對魚類無乳鏈球菌病的疫苗開發(fā)情況，旨在進(jìn)一步豐富、完善魚類無乳鏈球菌病的研究資料,為更好的防治魚類無乳鏈球菌病提供參考。

關(guān)鍵詞：無乳鏈球菌；鑒定；致病機(jī)理；疫苗開發(fā)

近年來，無乳鏈球菌已成為水生動(dòng)物鏈球菌病的主要病原之一。無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)，屬于鏈球菌科(Streptococcace)，鏈球菌屬(Streptococcus)，亦被稱為B組鏈球菌(Group BStreptococcus, GBS)，為兼性厭氧革蘭陽性的鏈狀球菌，能夠感染野生或養(yǎng)殖的水生動(dòng)物[1-3]。雖然無乳鏈球菌能夠感染不同宿主，但是魚源無乳鏈球菌的基因表達(dá)能使其更好的適應(yīng)魚類宿主[4]。據(jù)報(bào)道，異源的無乳鏈球菌也能夠引起魚類感染[5]，不同來源的無乳鏈球菌對魚類的致病性有所不同[6]。 無乳鏈球菌在自然界廣泛存在，所引起的魚病通常在26℃以上水溫發(fā)生, 近年來，魚類無乳鏈球菌病越來越受到關(guān)注,其發(fā)病率和死亡率高，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

1無乳鏈球菌病病原與癥狀

無乳鏈球菌為兼性厭氧革蘭陽性鏈狀球菌，直徑約0.5 μm ~2.0 μm，在液體培養(yǎng)基中成對或鏈狀排列，無芽胞、無鞭毛, 氧化酶陽性、過氧化氫酶陰性, 接種于血平板時(shí)呈β-溶血，部分為非溶血性(γ-溶血)[7]，最適生長溫度為28 ℃~37 ℃。魚類感染無乳鏈球菌的臨床癥狀包括食欲減退、單側(cè)或雙側(cè)眼球突出、眼球出血、角膜混濁、腹部腫脹、脊骨彎曲、鰭條基部出血等。病魚剖檢后可見腹腔血性腹水，胃腸道充血和腔壁變薄，腦膜充血，肝脾腫大，充血，心外膜有類纖維素樣物質(zhì)沉積，組織病理主要表現(xiàn)為肝臟、脾臟和腎臟細(xì)胞變性、壞死和炎性水腫，心肌炎和心外膜炎，腦膜炎和腦基質(zhì)炎性水腫，卡他性胃腸炎，鰓小片炎性水腫和上皮細(xì)胞壞死、脫落[8]。

2無乳鏈球菌致病機(jī)理

2.1致病途徑

無乳鏈球菌主要通過病魚的引入而在漁場間傳播，高溫、低溶氧和水體富營養(yǎng)化等環(huán)境因素會(huì)引起魚類產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，降低魚體對無乳鏈球菌的抵抗力。無乳鏈球菌入侵魚體的主要途經(jīng)是通過胃腸道進(jìn)入[9]，其表面的菌毛樣結(jié)構(gòu)，與該菌的定植、黏附和侵襲相關(guān)[10]。此外，無乳鏈球菌能夠逃避魚體的免疫吞噬和清除，并在魚體內(nèi)迅速繁殖擴(kuò)散，進(jìn)一步加劇組織器官的病理損傷[8]。無乳鏈球菌穿透羅非魚的血腦屏障，進(jìn)入腦組織后引起不同程度的組織病變，導(dǎo)致發(fā)病羅非魚出現(xiàn)游動(dòng)失衡、定向障礙等癥狀[8]。

2.2主要毒力因子

2.2.1莢膜多糖莢膜多糖(capsular polysaccharides, CPs)是特異性多糖，位于細(xì)菌表面，是無乳鏈球菌的主要毒力因子。無乳鏈球菌血清型是由莢膜區(qū)域的血清特異基因決定的，目前已知的血清型有10種血清型( Ia、Ib、Ⅱ-Ⅸ型)。免疫電鏡技術(shù)顯示，Ia、Ⅱ和Ⅲ型無乳鏈球菌的莢膜多糖含量較Ib型多[9]。cpsA、cpsB、cpsC、cpsD、cpsE、cpsL、neuB、neuD、neuA和neuC這10個(gè)基因在無乳鏈球菌的所有血清型中均高度保守[11]，cpsB到cpsJ， cpsL和cpsM存在于魚源無乳鏈球菌基因組中[12]，魚源cpsE基因推導(dǎo)氨基酸序列也具有高度保守性,與人源、動(dòng)物源無乳鏈球菌相似性達(dá)100%[13]。

2.2.2表面抗原無乳鏈球菌存在多種表面蛋白，已報(bào)道了無乳鏈球菌上存在的一些潛在的抗原能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這些抗原包括Cα和Cβ，Rib，表面免疫蛋白(surface immunogenic protein, Sip)， C5a肽酶等[14-17]。但是在大部分無乳鏈球菌菌株中，僅有Sip和C5a肽酶在基因水平上保守[16-18]。Sip蛋白是位于B群鏈球菌表面的一種蛋白,亦能夠被分泌到細(xì)胞外，該蛋白在9種血清型的菌株中均有表達(dá)(尚未知血清型Ⅸ中是否存在Sip蛋白)[16],具有高度保守性以及良好的抗原性[19]。ScpB 是無乳鏈球菌表面蛋白C5a肽酶 (streptococcol C5a peptidase from group BStreptococcus)的簡稱, 可以裂解人 C5a 補(bǔ)體的 His-67, 抑制炎癥反應(yīng)，對細(xì)菌黏附和入侵靶細(xì)胞及引起機(jī)體免疫反應(yīng)起介導(dǎo)作用，且存在于各個(gè)血清型中[20]。scpB 基因也存在于羅非魚源的無乳鏈球菌中，與人源無乳鏈球菌scpB 基因核苷酸序列的同源性為99.7%[21],說明scpB基因與無乳鏈球菌在魚體內(nèi)實(shí)現(xiàn)黏附和定植有關(guān)。

致病機(jī)理的研究對疾病采取正確有效的防治措施息息相關(guān)，目前針對無乳鏈球菌對魚類的致病機(jī)理研究的還不夠透徹，需要進(jìn)一步利用免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)對無乳鏈球菌毒力因子的致病機(jī)制進(jìn)行研究，揭示毒力因子與無乳鏈球菌發(fā)病的關(guān)系，才能為魚類無乳鏈球菌病的積極有效的防控打下基礎(chǔ)。

3無乳鏈球菌病的診斷

由于魚類疾病的一些臨床癥狀，例如單側(cè)或雙側(cè)眼球突出癥狀的出現(xiàn)，不僅僅由于一種原因引起，可能是因?yàn)椴◆~營養(yǎng)素缺乏，也可能是由氣單胞菌、愛德華氏菌、弧菌和鏈球菌等細(xì)菌引起。因此，要對魚類無乳鏈球菌病采取進(jìn)一步的治療措施，首先需要借助微生物學(xué)、血清學(xué)或者分子生物學(xué)等方法對無乳鏈球菌病進(jìn)行快速高效的診斷。

3.1微生物學(xué)方法

從病魚的腦，心臟、腎臟、脾臟或肝臟中取樣，按常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法包括菌落形態(tài)特征、菌株生化鑒定等，已有商品化的鏈球菌生化鑒定試劑盒可進(jìn)行無乳鏈球菌的鑒定，如Vitek-Gram positive 和 API rapid strep 32等。

3.2分子生物學(xué)方法

目前魚類細(xì)菌病常見的分子生物學(xué)診斷方法包括基于通用引物的16 S rRNA序列分析技術(shù)，靶向于某些編碼基因的特異性PCR診斷方法和核酸雜交技術(shù)等。多重PCR法是鑒定無乳鏈球菌的常見方法，在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，擴(kuò)增不同的特異性區(qū)域。根據(jù)羅非魚源無乳鏈球菌16 S rRNA基因和sip基因序列[22]，和根據(jù)魚源無乳鏈球菌莢膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列[23]建立的雙重PCR，能夠特異性針對無乳鏈球菌，其他常見水生動(dòng)物致病菌均無條帶檢出。與雙重PCR檢測法比較，三重PCR法靈敏度更高，根據(jù)sip、cpsE和cpsL 基因?yàn)橐锝⒌臋z測三重PCR法，對無乳鏈球菌DNA樣本的最低檢測濃度為0.32 ng/μL,能區(qū)別其他7種包括海豚鏈球菌在內(nèi)的常見魚類病原菌[24]。以無乳鏈球菌cpsE基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)特異性引物和寡核苷酸探針，建立的間接原位PCR方法[8]可以檢測無乳鏈球菌在魚體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布，是研究無乳鏈球菌對魚類致病機(jī)理的有效方法。巢式PCR也被用于檢測存在于冰凍和石蠟塊包埋的羅非魚組織中的無乳鏈球菌，該方法具有高度特異性，不會(huì)擴(kuò)增海豚鏈球菌(S.iniae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等其他魚類致病菌16 S-23 S rRNA區(qū)域[25]，可作為診斷和流行病學(xué)檢測的工具。

3.3免疫學(xué)方法

使用多克隆抗體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)法也被用于魚類無乳鏈球菌的診斷[26]，但該方法耗時(shí)較長，不能用于對魚源無乳鏈球菌進(jìn)行快速診斷。BioStar?OIA?STREP B能夠特異性針對無乳鏈球菌糖抗原，通過抗原抗體反應(yīng)，對人源無乳鏈球菌進(jìn)行快速鑒定。筆者用滅活的魚源無乳鏈球菌全菌開發(fā)的單克隆抗體，僅能針對免疫的菌株，對其他菌株反應(yīng)效果不佳(未發(fā)表結(jié)果)，因此需要使用在所有無乳鏈球菌血清型中都存在的蛋白作為抗原，制備單克隆抗體，才能更好的檢測不同血清型的無乳鏈球菌。Matsui H等[27]用重組Sip蛋白以及根據(jù)Sip蛋白氨基酸殘基序列的合成肽作為抗原制備單抗，在此基礎(chǔ)上研制的膠體金試紙條可檢測106CFU/mL的人源無乳鏈球菌，9種不同血清型,特異性99.6%，敏感性93.1%。目前尚未發(fā)現(xiàn)用Sip蛋白開發(fā)單克隆抗體以及檢測試紙條應(yīng)用于魚類無乳鏈球菌病診斷的報(bào)道。與人源無乳鏈球菌的快速診斷不同，魚類無乳鏈球菌病的診斷運(yùn)用還局限于傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離鑒定和分子生物學(xué)鑒定方法，運(yùn)用免疫原理進(jìn)行快速診斷的報(bào)道較少。盡管免疫學(xué)方法在人源無乳鏈球菌鑒定方面取得了一定成果，但是由于菌株之間存在的差異，尚不清楚這些檢測方法對魚源無乳鏈球菌特異性和敏感性如何。

4防治措施

4.1加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

采取科學(xué)的飼養(yǎng)管理方式，如加強(qiáng)養(yǎng)殖水質(zhì)的監(jiān)控和對外來魚種的檢疫、避免過度投料、控制養(yǎng)殖密度、及時(shí)處理病魚和死魚、保持良好的衛(wèi)生條件以及定期清潔消毒生產(chǎn)工具等等，盡可能的切斷病原傳播的途徑，能有效降低無乳鏈球菌病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

4.2藥物治療

化學(xué)藥物治療是我國魚類疾病控制最常見的方式，有報(bào)道無乳鏈球菌對阿莫西林、強(qiáng)力霉素和利福平等藥物敏感[28]。然而，長時(shí)間使用抗生素治療，細(xì)菌容易對藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥性，加上藥物殘留等問題，證明了抗生素治療手段并不是可持續(xù)的魚類疾病防控方式，要從根本上解決這一問題，還需要利用科學(xué)的方法研制針對無乳鏈球菌的疫苗。

4.3疫苗研究

由于使用抗生素治療魚類疾病會(huì)引起耐藥菌產(chǎn)生、藥物殘留等多種問題，使用疫苗對無乳鏈球菌病的防控就成了目前國內(nèi)外研究的重點(diǎn)。經(jīng)過無乳鏈球菌滅活疫苗免疫的羅非魚對無乳鏈球菌的抵抗力顯著提高，以注射法進(jìn)行第二次免疫后的相對保護(hù)率為78.33%[29]。用對司帕沙星耐藥篩選的無乳鏈球菌菌株制備減毒活苗免疫10 g~12 g的羅非魚，保護(hù)率可達(dá)75%~100%，同時(shí)使用含30株弱毒無乳鏈球菌制成的多價(jià)苗免疫羅非魚，該多價(jià)苗可對不同無乳鏈球菌菌株攻毒的羅非魚起到極顯著保護(hù)作用(P<0.001)[30]，說明無乳鏈球菌多價(jià)苗能對羅非魚提供廣泛的保護(hù)力。

滅活的全菌疫苗由于安全性好，制備簡單，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中應(yīng)用廣泛，但是全菌滅活苗的不同抗原成分對免疫效果會(huì)有影響，而弱毒疫苗畢竟是一種活疫苗，不排除毒力恢復(fù)的可能。因此，使用基因工程學(xué)和分子生物學(xué)手段，將無乳鏈球菌中能刺激魚體產(chǎn)生保護(hù)性作用的抗原分離，進(jìn)行疫苗研究，成了一個(gè)重要的研究方向。蛋白疫苗的開發(fā)，將會(huì)成為水產(chǎn)疫苗發(fā)展的主要方向，其優(yōu)點(diǎn)在于制備容易、使用劑量少、效果穩(wěn)定等。然而，無乳鏈球菌中不同的蛋白的免疫效果不盡相同，起到的保護(hù)力各不相同，因此選擇理想的蛋白進(jìn)行疫苗開發(fā)，是近年來的研究熱點(diǎn)。盡管無乳鏈球菌纖維蛋白原結(jié)合蛋白A(FbsA)和α-烯醇酶能調(diào)節(jié)羅非魚的先天免疫反應(yīng)和特異性抗體反應(yīng)，F(xiàn)bsA免疫的血清滴度(1∶1 600)高于α烯醇酶(1∶400)，但是重組的α-烯醇酶提供的相對免疫保護(hù)率更高(62.50%±18.75%)[31]，說明α-烯醇酶更適合作為疫苗研究的對象。尼羅羅非魚經(jīng)ScpB 蛋白免疫后,魚體內(nèi)IgM抗體水平迅速升高并能在一段時(shí)間內(nèi)維持在一個(gè)較高的水平，對羅非魚的相對保護(hù)率達(dá)89%[17],說明該蛋白在羅非魚體內(nèi)具有很好的免疫保護(hù)效果,將ScpB蛋白作為疫苗開發(fā)有一定的應(yīng)用前景。Liu G等[32]鑒定了16種無乳鏈球菌的免疫反應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)4種蛋白：富絲氨酸重復(fù)糖蛋白1(serine-rich repeat glycoprotein 1)、支鏈α酮酸脫氫酶亞單位E2(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase (BKD) subunit E2)、5′- 核苷酸酶家族蛋白(5′-nucleotidase family protein)和鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(ornithine carbamoyl transferase)，能與兔高免血清、豚鼠血清和無乳鏈球菌感染的羅非魚血清反應(yīng)，可作為疫苗研究的對象。經(jīng)Sip亞單位疫苗免疫的小鼠血清中抗體滴度可達(dá)5 851 428±2 189 404，極顯著高于全菌滅活苗組(8 000±2 962)[33]，免疫后的小鼠對Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅵ 6種不同血清型的無乳鏈球菌均能產(chǎn)生免疫力[16], 說明Sip蛋白有潛力成為抗無乳鏈球菌的通用候選疫苗。用重組表達(dá)的Sip蛋白免疫羅非魚，免疫保護(hù)率達(dá)70.3%[34]。利用減毒鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)SL7207作為載體開發(fā)的編碼Sip蛋白的DNA疫苗SL/pVAX1-sip，對羅非魚的毒性低，且能使羅非魚對野生株無乳鏈球菌攻毒產(chǎn)生有效保護(hù)作用[35]。

由于免疫的方法、養(yǎng)殖環(huán)境、魚類自身的差異等因素影響，能在水產(chǎn)養(yǎng)殖中運(yùn)用的商品化無乳鏈球菌疫苗目前正處于起步階段。無乳鏈球菌血清型較多，各血清型之間無交叉保護(hù)力，加上無乳鏈球菌的來源不同，各菌株的表面抗原表達(dá)情況也不相同，所以用滅活全菌作為免疫原，得到的抗體通常都是有菌株依賴性的，而選擇在各血清型之間都有的保守性抗原作為候選抗原疫苗，確保不同血清型間產(chǎn)生交叉保護(hù)力，是疫苗開發(fā)的一個(gè)重要方向。

5展望

目前對魚源無乳鏈球菌的研究多集中在不同血清型菌株的分離鑒定以及疫苗研發(fā)上，并取得了一定成果，但是關(guān)于無乳鏈球菌對魚類的致病機(jī)理仍然研究不夠透徹。近年來，由無乳鏈球菌引起的疾病給世界范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失，要做到切實(shí)有效的避免魚類無乳鏈球菌病的暴發(fā)和傳播，建立完善的監(jiān)測機(jī)制，及時(shí)采樣送檢以及使用快速準(zhǔn)確的方法進(jìn)行診斷，進(jìn)一步加強(qiáng)對該菌對于魚類侵染機(jī)制的研究，促進(jìn)疫苗的開發(fā)和應(yīng)用，才能為更好的防治魚類無乳鏈球菌病提供依據(jù)。

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StreptococcusagalactiaeInfection in Fish

CHENG Shi-liang1, LIU Xin-feng1, ZHENG Wen1, HUANG Yi-dan2,ZHANG Jun2, ZHENG Jian2

(1.ClinicalLaboratory,ShandongJiaotongHospital，Ji'nan,Shandong,250101,China;2.ArtronBiotechnology(Shandong)Inc,Ji'nan,Shandong, 250101,China)

Abstract:Sterptococcus agalactiae, also called group B Streptococcus, is a worldwide-distributed Gram-positive bacterium. It is a major bacterial pathogen to humans, and also to fish. Recently, S. agalactiae has become one of the major causes of streptococcosis in fish. The clinical signs of fish infected with S. agalactiae include exophthalmia, distended abdomen, curvature of the spinal cord, bleeding at the base of the fins, etc. Due to its high morbidity and mortality, the disease caused by S. agalactiae leads to serious economic loss and threats the sound development of aquaculture. This paper overviewed the research progress on the fish disease caused by S. agalactiae, and introduced its pathogenesis, the methods of identification and the current development of vaccines against S. agalactiae from fish in order to provide references for the further investigation on S. agalactiae, as well as the disease control and prevention in aquaculture.

Key words:Streptococcus agalactiae; identification; pathogenesis; vaccine development

文章編號:1007-5038(2016)02-0105-05

中圖分類號:S852.611

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：程世亮(1981-)，男，山東濟(jì)南人，學(xué)士，主要從事微生物實(shí)驗(yàn)室診斷研究。 *通訊作者

收稿日期：2014-10-09