馬大威

(黃石市陽新縣第三人民醫(yī)院，湖北黃石 435000)

·臨床研究·

肌紅蛋白在氧化鎳納米粒子中的固定及新型生物傳感器的制備

馬大威

(黃石市陽新縣第三人民醫(yī)院，湖北黃石 435000)

摘要:目的對(duì)肌紅蛋白(Mb)在氧化鎳納米粒子中的固定情況和新型生物傳感器的制備情況進(jìn)行探討。方法測(cè)試氧化鎳納米粒子改性石墨電極(GE)上Mb所表現(xiàn)出來的電化學(xué)情況，同時(shí)進(jìn)行新型生物傳感器制備。結(jié)果Mb固定在Mb/氧化鎳(NiO)/二甲亞砜(DMSO)膜中時(shí)，其分子所具有的活性能夠得到更好的維持，其對(duì)H2O2具有電催化活性，且表觀米氏常數(shù)具體為0.21 mmol/L、靈敏度表現(xiàn)為417mA cm2L/mol,具有極高的親和性；Mb的檢出限表現(xiàn)為0.039 μmol/L。結(jié)論Mb存在明顯和穩(wěn)定的氧化還原峰，Mb分子與電極間發(fā)生的電子傳遞受到DMSO的嚴(yán)重影響；將其固定于Mb/NiO/DMSO膜中時(shí)，更有利于其分子活性的維持，其對(duì)H2O2表現(xiàn)出高親和性。

關(guān)鍵詞:肌紅蛋白；氧化鎳納米粒子；新型生物傳感器

肌紅蛋白(Mb)為具有1個(gè)含鐵血紅素輔基和153個(gè)氨基酸的多肽鏈共同組合而成的一個(gè)亞鐵血紅素蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量為17.5×103，其在機(jī)體中主要存在于心肌、骨骼肌等組織中[1]。加強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)電催化、直接電化學(xué)的深入研究，對(duì)認(rèn)識(shí)機(jī)體電子轉(zhuǎn)移機(jī)制、相關(guān)具有生命物質(zhì)在機(jī)體中的代謝情況等均具有極為重要的價(jià)值[2]。目前，諸多學(xué)者在研究過程中，利用納米材料、離子聚合物等進(jìn)行組裝、交聯(lián)等之后，使血紅素蛋白質(zhì)能夠被固定在電極表面，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)Mb與電極存在的傳遞關(guān)系進(jìn)行研究。本研究中主要對(duì)Mb在納米粒子上的固定情況進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料在本研究中，在石墨電極的表面進(jìn)行氧化鎳(NiO)納米粒子修飾，然后將Mb固定于石墨電極的表面，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)在電極上所發(fā)生的直接電化學(xué)行為進(jìn)行分析和研究。

1.2儀器與試劑本研究所應(yīng)用到的相關(guān)儀器主要有：CHI660C電化學(xué)工作站(生產(chǎn)企業(yè)：上海辰華儀器公司)、Vector22FT-IR傅立葉紅外光譜(生產(chǎn)企業(yè)：Bruker公司)、掃描電子圖像分析儀(生產(chǎn)企業(yè)：德國Gemini公司)、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(生產(chǎn)企業(yè)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，此外還有石墨電極(GE)和飽和甘汞電極(SCE)。研究中所用的試劑主要有：M1882 Mb，研究所用水均為二次蒸餾水，使用到的其他試劑全部為分析純。研究過程中還需要溶液A、溶液B、溶液C共3種溶液；A種為Mb濃度為2.0 g/L水溶液；B種為NiO濃度為4.0 g/L二甲亞砜(DMSO)懸浮液；C種為溶液NiO濃度為4.0 g/L水溶液。

1.3方法(1)納米NIO制備：本研究主要應(yīng)用氣相法中的噴霧熱分解法來實(shí)現(xiàn)納米NiO的制備；(2)電極制備：本研究所用石墨電極的面積為0.263 5 cm2。進(jìn)行試驗(yàn)之前，首先需對(duì)石墨電極進(jìn)行打磨處理，然后使用氧化鋁(0.05 μm)在麂皮上繼續(xù)實(shí)施打磨操作，使其呈現(xiàn)出鏡面。在實(shí)施拋光操作之前，均須使用二次蒸餾水對(duì)電極進(jìn)行徹底清洗。拋光操作結(jié)束之后需要依次使用丙酮、二次蒸餾水對(duì)電極進(jìn)行超聲清洗，清洗的時(shí)間為5 min，清洗完畢后將其放置于室溫環(huán)境中晾干；(3)電極制備：本研究需進(jìn)行6種電極的制備，其分別為裸電極、NiO/DMSO/GE電極、Mb/GE電極、Mb/NiO/GE電極、Mb/DMSO/GE電極、Mb/NiO/DMSO/GE電極。將所有電極放置于干燥瓶中，放置時(shí)間為2 h，使水分得到有效揮發(fā)，進(jìn)而形成均勻膜。將電極放置于密封瓶中，放置時(shí)間為12 h，密封瓶恒溫為18 ℃。電極制成之后使用二次蒸餾水將其進(jìn)行徹底沖洗，然后進(jìn)行護(hù)理放置以備研究使用。測(cè)試方法：本研究應(yīng)用的電極系統(tǒng)為三電極系統(tǒng)，首先將GE修飾成為工作電極，而輔助電極則為鉑絲，參比電極為SCE。電極系統(tǒng)設(shè)計(jì)好之后將其與電化學(xué)工作站進(jìn)行連接，然后實(shí)施電化學(xué)測(cè)量試驗(yàn)。在無特別說明的情況下，將相對(duì)于SCE的電位作為測(cè)量中的電位值均。實(shí)施循環(huán)伏安試驗(yàn)的環(huán)境，須將恒溫控制在(18±0.2)℃的范圍內(nèi)，且整個(gè)試驗(yàn)須在靜止的電化學(xué)電解池中實(shí)施。在測(cè)試過程中，合理地將電解池溫度升高，且相應(yīng)溫度位置保持時(shí)間為20 min恒溫，然后對(duì)循環(huán)伏安圖進(jìn)行記錄。通過這樣的方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)Mb/NiO/DMSO/GE所表現(xiàn)出來的實(shí)際穩(wěn)定性進(jìn)行分析。在實(shí)施試驗(yàn)之前，需進(jìn)行的相關(guān)電化學(xué)測(cè)試(均通過時(shí)間為15 min的純氮，將存在于電解液中的溶解氧去除)。在試驗(yàn)實(shí)施的整個(gè)過程需始終保持處在氮的環(huán)境中。實(shí)施安培檢測(cè)操作時(shí)，將工作電位設(shè)置為-350 mV，將檢測(cè)所測(cè)得的電流-起始電流所得數(shù)值作為催化電流。在聚四氟乙烯片上分別滴上Mb，Mb/DMSO溶液，Mb/NiO/DMSO或Mb/NiO/H2O懸浮液，然后將聚四氟乙烯片放置于空氣中進(jìn)行晾干，然后揭下膜，實(shí)施KBr壓片操作之后進(jìn)行測(cè)試。將20次掃描所得結(jié)果的平均值制成每次測(cè)量的圖譜。分別在玻璃片上進(jìn)行NiO修飾、Mb修飾、Mb/NiO/DMSO修飾，然后實(shí)施掃描電子圖像分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究所得相關(guān)數(shù)據(jù)均使用Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理。

2結(jié)果

當(dāng)Mb混合到水、DMSO溶液、NiO/水懸浮液、NiO/DMSO溶液中時(shí)，Mb均能夠保持其原有的結(jié)構(gòu)；將Mb固定在Mb/NiO/DMSO膜中時(shí)，更利于保持Mb分子的活性，且其天然結(jié)構(gòu)也不會(huì)遭受破壞,其對(duì)H2O2具有電催化活性，且表觀米氏常數(shù)具體為0.21 mmol/L、靈敏度表現(xiàn)為417 mA cm2L/mol,具有極高的親和性，Mb的檢出限表現(xiàn)為0.039 μmol/L；當(dāng)pH值在5～10范圍之內(nèi)時(shí)，溶液pH值與式量電位表現(xiàn)出線性關(guān)系，其斜率為-42.3 mV/pH(r=0.999 3)，不僅接近于-43.9 mV/pH，同時(shí)也與291K時(shí)的理論值(-57.8 mV/pH)接近，這說明Mb的電子傳遞受溶液pH值影響。

3討論

Mb為一種氧結(jié)合蛋白，其在機(jī)體中主要存在于平滑肌、骨骼肌、心肌等組織中。存在肌肉中的所有蛋白中，Mb所占比例為2%左右[3]。Mb具有極小的相對(duì)分子質(zhì)量，其相對(duì)分子質(zhì)量僅為17.8×103，明顯小于肌酸激脢(CK-MB)和乳酸脫氫酶[4]。Mb位于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)部。在病理生理學(xué)中，存在于機(jī)體中的心臟標(biāo)志物出現(xiàn)時(shí)間的早晚和分子在細(xì)胞中的部位、分子大小均存在密切聯(lián)系。相對(duì)分子質(zhì)量越小，更易于其直接透過細(xì)胞存在的微小間隙，進(jìn)入到血液中。所以當(dāng)心肌損傷發(fā)生時(shí)，Mb會(huì)較早出現(xiàn)，目前，其為急性心梗出現(xiàn)之后能夠最早檢測(cè)得到的標(biāo)志物。

當(dāng)Mb處在溶液時(shí)，其對(duì)溶液的吸收均會(huì)存在一個(gè)吸收峰，這個(gè)吸收峰就是其在該種溶液中的Soret吸收帶[5]。但Soret吸收帶消失或者發(fā)生遷移時(shí)就提示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了相應(yīng)的變化。在Mb分子中，多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)信息主要依靠酰胺Ⅰ、Ⅱ紅外吸收帶提供。在蛋白質(zhì)失去活性時(shí)，其分子中的酰胺Ⅰ、Ⅱ所具有的特征吸收帶會(huì)發(fā)生明顯變化，吸收帶甚至?xí)耆6]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)Mb固定在Mb/NiO/DMSO膜中時(shí)，其分子活性不易失去，且天然結(jié)構(gòu)也不會(huì)發(fā)生明顯變化。

DMSO在蛋白質(zhì)電子傳遞過程中發(fā)揮著極為重要的作用，導(dǎo)致這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因主要為DMSO能夠降低存在于Mb分子周圍環(huán)境中雙電層常數(shù)，進(jìn)而降低了蛋白質(zhì)電子在進(jìn)行傳遞過程中外部重組能，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)電子在傳遞過程中的速度不斷加快[7]。但是在Mb電子傳遞過程中，NiO納米粒子發(fā)揮著更加重要的作用，NiO納米粒子可創(chuàng)造出一個(gè)三維界面，這個(gè)三維界面能夠讓受限的方位同樣也適合蛋白質(zhì)分子與電極表面間的直接電子傳遞，因此，蛋白質(zhì)分子的電子傳遞會(huì)得到有效加快[8-9]。同時(shí)，NiO納米粒子具有強(qiáng)烈的吸附性，其更多的Mb會(huì)被其吸附，且將Mb吸附之后洗脫難度大，因此表現(xiàn)出較強(qiáng)的信號(hào)。

在本研究中，當(dāng)將Mb/NiO/DMSO/GE在pH值為7.0的聚丁二酸丁二醇酯(PBS)中進(jìn)行連續(xù)性掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)，其表現(xiàn)出來的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.887%，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差表明Mb/NiO/DMSO修飾電極存在良好的重復(fù)性。當(dāng)將修飾電極放置于恒溫為4 ℃，pH值為7.0的PBS中，放置時(shí)間為60 d，然后進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示峰電流值是原來峰電流值的94%，這個(gè)結(jié)果表明Mb/NiO/DMSO/GE存在良好的穩(wěn)定性。將蛋白質(zhì)固定在導(dǎo)電性物質(zhì)表面時(shí)，其出現(xiàn)的行為會(huì)和其所處于溶液中的行為發(fā)生一定的變化。熱力學(xué)穩(wěn)定性試驗(yàn)所得結(jié)果表明，Mb/NiO/DMSO/GE熱力學(xué)穩(wěn)定性的增加與NiO納米粒子的存在具有密切聯(lián)系[10]。

溶液中的pH值對(duì)Mb直接電子傳遞存在明顯性影響。當(dāng)溶液的pH值處于5～10的范圍之內(nèi)時(shí)，溶液pH值和式量電位表現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，具有-42.3 mV/pH的斜率，該斜率接近于-43.9 mV/pH，同時(shí)也與291 K時(shí)的斜率理論值較為接近。這個(gè)結(jié)果表明，在電子傳遞過程過程中還有1個(gè)電子和1個(gè)質(zhì)子參與。當(dāng)溶液的pH值為7.0時(shí)，電子傳遞出現(xiàn)最高的峰電流值。因此在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，所應(yīng)用的電解質(zhì)溶液通常會(huì)選擇pH值為7.0的PBS緩沖體系。

對(duì)于H2O2，Mb/NiO/DMSO/GE表現(xiàn)出明顯的電催化作用。當(dāng)將H2O2加入到pH值為7.0的PBS中之后，還原峰電流會(huì)表現(xiàn)出明顯增加的趨勢(shì)，而氧化峰電流則表現(xiàn)出明顯減小的趨勢(shì)。這種現(xiàn)象在NiO/DMSO/GE上，或者在裸GE上均未出現(xiàn)。這種表明，H2O2所表現(xiàn)出來的催化還原作用主要是由于有Mb分鐘存在于電極上，且H2O2表現(xiàn)出來的催化效果具有明顯性。在本研究中，當(dāng)在連續(xù)性地將適量的H2O2加入到pH值為7.0的PBS中時(shí)，在將工作電位選擇為-350 mV時(shí)，修飾電極對(duì)H2O2表現(xiàn)出較為理想的電催化活性，同時(shí)，在短短5 s的時(shí)間之內(nèi)，穩(wěn)態(tài)電流可高達(dá)95%。這個(gè)結(jié)果說明了電催化響應(yīng)具有極快的速度，所以可有應(yīng)用于H2O2的檢測(cè)，且會(huì)大大提高檢測(cè)的速度。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.045

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)10-1404-03

(收稿日期：2016-01-03)