劉坤友

(廣西柳江縣人民醫(yī)院檢驗科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com)

綜 述

中藥抗耐藥大腸埃希菌的機制研究進展▲

劉坤友

(廣西柳江縣人民醫(yī)院檢驗科，柳江縣 545100，E-mail：Ljrylky@163.com)

耐藥大腸埃希菌是社區(qū)和醫(yī)院感染的常見致病菌之一，其耐藥機制復(fù)雜多變。中藥及其方劑抗耐藥大腸埃希菌的機制主要有抑制超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、消除R質(zhì)粒、改變細菌外膜通透性、干擾細菌的代謝、提高機體免疫功能及消除炎癥反應(yīng)等。構(gòu)建新的方劑，純化中藥的有效成分、明確其分子結(jié)構(gòu)，探討其消除耐藥的機理，是今后研究的方向。

大腸埃希菌；耐藥；中藥；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；R質(zhì)粒；細菌外膜；綜述

大腸埃希菌是臨床最常見的一種致病菌，常引起爆發(fā)流行，也是引起醫(yī)院內(nèi)感染和社區(qū)獲得性感染重要病原菌之一。在近10 年的醫(yī)院細菌檢驗標本中，大腸埃希菌標本數(shù)量歷年均居前5位[1]。據(jù)2013年我國細菌耐藥監(jiān)測報告，在檢出的致病菌中，大腸埃希菌居首位占18.3%，其耐藥菌株占72.2%，且對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢呋辛、慶大霉素、氨芐西林/舒巴坦、頭孢曲松等一線抗生素高度耐藥[2]，給臨床治療帶來極大的困難。中醫(yī)藥治療感染性疾病歷史悠久，療效顯著，從中草藥中尋找抗耐藥的有效成分、研發(fā)新型抗感染藥物已成為當前國內(nèi)外有關(guān)研究的熱點之一。本文對中藥抗耐藥大腸埃希菌的研究進展綜述如下。

1 抑制超廣譜β-內(nèi)酰胺酶

大腸埃希菌耐藥機制非常復(fù)雜，且變化迅速，其中產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是其重要機制之一。ESBLs因能水解β胺類抗生素(氨曲南、卡蘆莫南等)而使細菌產(chǎn)生耐藥。ESBLs的活性可以被克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等ESBLs抑制劑所抑制，因此抑制ESBLs的活性、減少其分泌量，是消除大腸埃希菌耐藥的有效途徑之一[3]。

近年，國內(nèi)學者對中草藥進行大規(guī)模研究后發(fā)現(xiàn)，體外具有抑菌作用的中草藥繁多，主要集中在清熱解毒(半枝蓮、金銀花、板藍根、魚腥草、白頭翁、穿心蓮、白花蛇舌草等)、清熱燥濕(大黃、黃芩、黃連、黃柏、龍膽草、苦參等)、清熱瀉火(知母、天花粉、梔子、夏枯草等)、理氣化痰(橘紅、薤白、白芥子、蘇子等)、活血化淤(厚樸、桃仁、川芎、川斷、丹參、紅花)等中藥，其水提物濃度為0.1～0.8 g/ml時即對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌有較強的抑制作用，用這些中藥組成的方劑治療感染性疾病具有較好的臨床效果。雙黃連粉針劑(哈藥集團中藥二廠)和清開靈注射液[由膽酸、珍珠母(粉)、豬去氧膽酸、梔子、水牛角(粉)、板藍根、黃芩苷和金銀花組成，神威藥業(yè)有限公司]均具有廣譜抗菌作用，是治療感染性疾病的常用藥物，能減輕臟器損傷，消除患者菌血癥癥狀，縮短臨床病程，提高治療效果。雷云[4]用雙黃連粉針劑、清開靈注射液處理產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌，其 ESBLs活性為(3.68±0.21)U/mg，明顯低于空白對照組的(12.75±0.42)U/mg(P<0.05)，說明雙黃連粉針劑、清開靈注射液抑制大腸埃希菌是通過降低ESBLs活性實現(xiàn)的。

三黃湯(大黃、黃連、黃芩)、黃連解毒湯(黃連、黃芩、黃柏、梔子)、五味消毒飲(金銀花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子、野菊花)是治療消化、呼吸、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染性疾病的常用方藥。賈云鵬等[5]用試管二倍稀釋法測定3種中藥方劑的最低抑菌濃度分別為0.2 g/ml、0.1 g/ml、0.3 g/ml，認為3種方劑對多重耐藥的大腸埃希菌均有抑制作用，酶活性測定試驗發(fā)現(xiàn)其能降低ESBLs活性；采用Bradford法測定菌體內(nèi)蛋白質(zhì)總含量，發(fā)現(xiàn)3 種方劑能減少ESBLs的產(chǎn)量的含量；三黃湯、黃連解毒湯、五味消毒飲體外抑制試驗效果與ESBLs抑制劑——克拉維酸相當，但抑制ESBLs活性及減少ESBLs的含量效果卻不及克拉維酸(P<0.05)，說明三黃湯、黃連解毒湯、五味消毒飲逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性尚存在其他機制。目前已發(fā)現(xiàn)ESBLs基因型有200余種，主要為CTX-M、TEM、OXA和SHV型[6]，但三黃湯對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的體內(nèi)的ESBLs編碼基因OXA有抑制作用，可使其表達量下降，而對TEM、CTX-M、SHV、Acr-AB基因無明顯抑制作用[7]。

2 消除R質(zhì)粒

質(zhì)粒是細菌核質(zhì)以外的DNA，其種類繁多，其中R質(zhì)粒攜帶著耐藥基因。R質(zhì)?？梢栽诰w內(nèi)復(fù)制，在細胞分裂時傳給子代細菌；也可以通過細菌菌毛、噬菌體等媒介在細菌間傳播，從耐藥菌株轉(zhuǎn)移到敏感菌，使耐藥性得以快速傳播[8-9]。因此，通過消除耐藥大腸埃希菌R 質(zhì)粒，可使藥物恢復(fù)敏感性。

李玉虎等[10]用木香、黃精水煎提取液與痢疾桿菌氯霉素耐藥株(S.flexneRiD15 R-plasmid CmR)和大腸埃希菌氯霉素敏感株(Escherichiacoli1485 RifR)培養(yǎng)48 h后，兩種細菌間R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移率為3.5%，明顯低于R質(zhì)粒自然轉(zhuǎn)移率63.5%(P<0.01)；R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移抑制率95.9%，與消除劑——溴化乙錠的R質(zhì)粒轉(zhuǎn)移抑制率(95.3%)比較，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明木香、黃精能抑制CmR質(zhì)粒；在S.flexneRiD15 R-plasmid CmR與Escherichiacoli1485 RifR間的接合傳遞，從而使質(zhì)粒在細菌間的接合傳遞受阻，能控制細菌耐藥性的產(chǎn)生和蔓延。

黃連、黃芩、大黃是最常用的清熱、燥濕、瀉下中藥，由其組成的二黃湯1號(黃連+大黃)、二黃湯2號(黃芩+大黃)、三黃湯(黃芩+黃連+大黃)、三黃片(大黃+黃芩總苷+鹽酸黃連素)是治療肺炎、細菌性痢疾、腹瀉等感染性疾病的常用藥物，體外實驗證明其水煎提取液能有效抑制大腸埃希菌的作用；通過質(zhì)粒圖譜比對分析，表明大腸埃希菌的耐藥逆轉(zhuǎn)率為11%；用堿裂解法進行質(zhì)粒抽提，對大腸埃希菌耐藥R質(zhì)粒消除率為31%，質(zhì)粒變化相關(guān)度(耐藥逆轉(zhuǎn)與質(zhì)粒丟失之間的關(guān)系)達75%以上。說明其逆轉(zhuǎn)細菌耐藥性作用的機制可能與耐藥質(zhì)粒的消除有關(guān)，R質(zhì)粒消除后可能部分改變了染色體的結(jié)構(gòu)，造成染色體上耐藥基因的失活或丟失等[11]。

雷云[4]采用凝膠成像儀進行檢查， 發(fā)現(xiàn)使用雙黃連及清開靈前后耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒圖譜中丟失一條R 質(zhì)粒帶，說明其可消除耐藥大腸埃希菌R質(zhì)粒。然而，康梅等[12]的研究表明，雖然三黃片對大腸埃希菌有非常明顯的抑制作用，但質(zhì)粒指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒譜卻無改變，說明其未真正消除質(zhì)粒，其抗菌作用可能是滅活該耐藥質(zhì)?；蛞种屏速|(zhì)粒介導的耐藥性基因表達，這也說明這類中藥的抗大腸埃希菌機制十分復(fù)雜。

克痢痧(由白芷、蒼術(shù)、石菖蒲、細辛、蓽茇、鵝不食草、豬牙皂、丁香、硝石、白礬、雄黃、冰片組成，浙江蘇泊爾南洋藥業(yè)有限公司)對大腸埃希菌有明顯的抑菌作用，是治療腹瀉與細菌性痢疾的常用藥物之一。李延鴻等[13]對耐慶大霉素、氨芐西林的致病性大腸埃希菌，加克痢痧培養(yǎng)24 h，用紫外透射儀檢測凝膠分析系統(tǒng)攝像分析，顯示質(zhì)粒帶消失，R質(zhì)粒消除率為17.45%，與傳統(tǒng)R質(zhì)粒消除劑——十二烷基硫酸鈉比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明克痢痧消除大腸埃希菌R質(zhì)粒的作用是非常強大的?？傮w而言，中藥消除質(zhì)粒作用低于化學消質(zhì)劑(如十二烷基硫酸鈉)，而單味中藥消除大腸埃希菌R 質(zhì)粒的作用不及復(fù)方中藥。

3 改變細菌外膜通透性

細菌外膜具有阻止抗生素等外來物質(zhì)入侵的作用，使細菌自身得以生存和繁殖。大腸埃希菌外膜mar區(qū)基因突變導致F、C蛋白減少或缺失，使細菌細胞壁或外膜通透性改變而產(chǎn)生多重耐藥性[14]。

千里光有清熱解毒的功用，體外實驗證明其能有效抑制大腸埃希菌。張文平等[15]用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)千里光處理的大腸埃希菌，菌體表面粗糙，部分菌體出現(xiàn)縊痕，并在縊痕處出現(xiàn)縊縮或斷裂等變化；同位素前體參入試驗發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA、RNA、蛋白質(zhì)和肽聚糖合成也受到明顯的抑制。這些作用可能與其有效成分黃酮類化合物有關(guān)。張金霞等[16]采用丙酮加熱回流法對中藥當歸進行提取，其對大腸埃希菌的最低抑菌濃度為2 500 μg/ml。掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)測試菌變形，失去原有形態(tài)；大部分測試菌細胞壁和細胞膜破裂，內(nèi)容物外溢。藥物濃度越高，上述改變越明顯。

黃衍強等[17]發(fā)現(xiàn)對氧氟沙星、環(huán)氧沙星和諾氟沙星等多重耐藥性大腸埃希菌均出現(xiàn)解旋酶基因(gyrase subunit A，gyrA) 基因突變，主要是第83和87位點分別出現(xiàn)C-T和G-A的突變。在含黃連素、大黃素、苦參堿等提取物的脅迫環(huán)境下培養(yǎng)多重耐藥性大腸桿菌30 d，傳代15次，經(jīng)PCR擴增gyrA基因，檢測基因序列后未發(fā)現(xiàn)上述突變基因有回復(fù)跡象，認為黃連素、大黃素、苦參堿等對多重耐藥大腸埃希菌的抑制作用，可能與生物膜被抑制或調(diào)控外排泵被黃連素、大黃素、苦參堿抑制有關(guān)，而與gyrA基因的突變回復(fù)無關(guān)。

羅芬芳[18]研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素、沒食子酸體外實驗對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌無抑制作用，但可提高β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。單獨的黃藤素或聯(lián)合頭孢噻肟與產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌增殖培養(yǎng)15代，采用實時熒光定量PCR檢測產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌酶基因mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)ESBLs酶基因blaCTX-M-1G、blaCTX-M-9G的mRNA表達水平無明顯改變，表明黃藤素的抗菌增敏感作用不是通過影響β-內(nèi)酰胺酶mRNA表達水平實現(xiàn)的；單獨的沒食子酸或聯(lián)合頭孢噻肟與產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌增殖培養(yǎng)15代，對ESBLs酶基因blaCTx-M-1G mRNA表達水平無明顯影響，但能降低ESBLs酶基因blaCTX-M-1G mRNA表達水平，沒食子酸對頭孢噻肟的增敏作用可能是通過這一機制實現(xiàn)的。

銀花泌炎靈片(吉林華康藥業(yè)股份有限公司)由車前子、桑寄生、金銀花、半枝蓮、燈芯草、半枝蓮、萹蓄等清熱利濕中藥組成，治療泌尿系感染、前列腺炎、慢性盆腔炎等疾病的總有效率達到90%。賽景影等[19]研究證明，銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌標準菌株ATCC2592和產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌有明顯的抑制作用。掃描電子顯微鏡下觀察，經(jīng)銀花泌炎靈片95%乙醇提取物作用后，超薄切片透射電子顯微鏡可見菌體固縮膨大，細胞壁模糊不清甚至缺失，細胞質(zhì)固縮解體，形成小空泡；負染透射電子顯微鏡下可見菌體變形并出現(xiàn)褶皺，細胞壁出現(xiàn)凹陷。認為銀花泌炎靈片的抑菌機制可能是藥物干擾或破壞大腸埃希菌細胞壁合成或破壞菌體內(nèi)大分子量蛋白，以致菌體超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變。王槐棟等[20]在含左氧氟沙星的培養(yǎng)基中對大腸埃希菌ATCC25922連續(xù)傳代，用DNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)其編碼parC基因第381位發(fā)生突變，A→T，其編碼的賴氨酸(127)→天冬酰胺，并在第386位堿基插入T。而用銀花泌炎靈片95%乙醇提取物則無此現(xiàn)象，說明在特定的環(huán)境壓力下銀花泌炎靈片不容易誘導大腸埃希菌發(fā)生耐藥性，細菌外膜parC基因突變可能是細菌耐藥性產(chǎn)生的原因之一。

4 干擾細菌的代謝

細菌可以通過改變自身的代謝途徑以對抗抗菌藥物而獲得耐藥性。細菌外膜存在一種能改變自身結(jié)構(gòu)的膜蛋白，在細菌自身能量支持下將藥物選擇性或非選擇性地排出細菌細胞外，如細菌外排泵，抗生素很容易誘導細菌外排泵的超表達，使細菌泵出更多的抗菌藥物，從而使靶位的藥物濃度明顯降低以利于細菌生存，由此導致細菌耐藥或多重耐藥[21]。

尉景娟等[22]采用瓊脂稀釋法測定黃芩黃酮、大黃蒽醌、敗醬草皂苷、白頭翁皂苷、重樓皂苷A、大血藤鞣、丹參素及丹參酮ⅡA等8種中藥單體的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)其對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌、不產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌均有抑菌作用，其體外最低抑菌濃度基本相同，說明這8種中藥單體的抑菌作用不受ESBLs的影響，其機制可能與干擾細菌的代謝有關(guān)。桂勇等[23]報告烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌株的體外抑菌活性，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。上述研究表明前述中藥雖對ESBLs沒有水解作用，而這些中藥中含有的一些特殊成分如五倍子中的鞣酸、黃連中的小檗堿等卻均能抑制和干擾細菌的代謝。

細菌外排泵抑制劑是提高抑菌敏感度的一條有效途徑。張靜等[24]用142種中藥提取液對大腸埃希菌進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其有明顯的抑菌作用，用熒光定量PCR技術(shù)證實，這些中藥是通過下調(diào)大腸埃希菌的外排泵acrA基因mRNA表達而實現(xiàn)的。進一步將142種中藥提取液、乳酸環(huán)丙沙星加入大腸埃希菌培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)，僅4種(2.8%)藥液能促使菌體內(nèi)藥物外排量減少、儲存量增加，從而提高藥物的敏感性；124種(87.3%)中藥提取物與乳酸環(huán)丙沙星(細菌外排抑制劑)聯(lián)用表現(xiàn)為拮抗作用，說明大部分中藥的抑菌作用不是通過細菌外排泵抑制機制實現(xiàn)的，而是存在其他作用機制。

5 提高機體免疫功能，消除炎癥反應(yīng)

提高機體免疫力、消除炎癥反應(yīng)是中藥抗細菌耐藥的機制之一。楊東等[25]用吸附樹脂法、離子交換法和硅膠層析法，從白鮮皮水煎液中分離出生物堿類成分BXP-A。給小鼠注射抗內(nèi)毒素/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)造成毒血癥，然后給毒血癥小鼠靜脈注射BXP-A，發(fā)現(xiàn)BXP-A能較好地中和LPS的作用，抑制炎癥細胞釋放腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)和白細胞介素(interleukin，IL)-6，對熱滅活的LPS 攻擊所致膿毒癥模型小鼠具有保護作用。

小檗堿是從黃連、黃柏等中藥提取的生物堿，體外實驗證明其具有抗細菌和病毒感染、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、降血糖、改善心腦血管循環(huán)等功效。莊浩林等[26]報告其對產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌的最低抑菌濃度為62.5 g/L，并能降低血清TNF-α，IL-6含量，與抗生素聯(lián)用則具有增敏作用。認為小檗堿保護大腸埃希菌所致的小鼠菌血癥模型，是通過消除炎癥反應(yīng)、提高機體免疫功能實現(xiàn)的。

苗健等[27]對大腸埃希菌腹膜炎誘發(fā)的膿毒癥大鼠模型，用復(fù)方清下湯(大黃、厚樸、 枳實、 芒硝、連翹、公英、 金銀花、梔子、牡丹皮)灌胃，發(fā)現(xiàn)血清IL-1、IL-6水平明顯降低(P<0.01)；組織病理顯示肺濕/干比值明顯降低(P<0.01)，鏡下見肺毛細血管內(nèi)皮細胞腫脹減輕，纖維素滲出減少，出血減輕，肺泡間隔變窄。認為復(fù)方清下湯對膿毒癥大鼠的保護作用是通過消除炎癥反應(yīng)實現(xiàn)的。

顧向晨等[28]對大腸埃希菌感染的膀胱炎SD大鼠，灌注二丁二仙湯(地丁草、蒲公英、知母、黃柏、仙靈脾、仙茅、巴戟天、當歸)后膀胱刺激癥狀明顯減輕，采用Western Blot法檢測膀胱組織中的TNF-α、抑制性卡巴蛋白(inhibitor-kappaB α，IKBα)、磷酸化抑制性卡巴蛋白，發(fā)現(xiàn)其表達量明顯下降，膀胱雌激素受體βmRNA明顯上升(P<0.05)。認為二丁二仙湯預(yù)防泌尿道感染發(fā)生，其機制可能為上調(diào)血清雌激素，局部激活膀胱雌激素受體β，調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B通路，抑制IKBα磷酸化，下調(diào)TNF-α分泌。

6 問題與展望

大腸埃希菌耐藥機制非常復(fù)雜，且變化迅速，是臨床治療中的一個棘手問題。近年的研究證明，清熱解毒、燥濕瀉火及活血化淤中藥對大腸埃菌有較好的抑制作用，但研究多集中在體外抑制大腸埃希菌效果觀察方面，對其有效成分、機理的研究不多。中藥成分復(fù)雜，在人體內(nèi)可能存在協(xié)同作用。從發(fā)現(xiàn)青蒿素并取得諾貝爾獎的啟示中可見，構(gòu)建新的方劑，純化中草藥的有效成分并弄清其分子結(jié)構(gòu)，探討其消除耐藥的機理，是今后研究的方向。

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廣西醫(yī)藥衛(wèi)生科研課題(Z2010047)

劉坤友(1973～)，男，本科，副主任技師，研究方向：醫(yī)學檢驗。

R 284

A

0253-4304(2016)06-0842-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.24

2018-01-18

2016-04-18)