于新友，李天芝，苗立中

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院）

環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術及其在鴨病病原檢測中的應用研究進展

于新友1，李天芝1，苗立中2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院）

環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術是一門新興的分子生物學檢測技術，因其具有特異性強、靈敏度高、快速、準確、操作簡便和成本低等特點，越來越受到獸醫(yī)相關工作者的關注。目前，該方法已被廣泛應用各種動物病原的檢測。綜述LAMP技術在鴨傳染病病原檢測中的應用研究進展情況，以期為今后鴨病的診斷和防控工作提供參考。

LAMP；鴨病；病原；檢測；應用

鴨傳染病對養(yǎng)鴨業(yè)的威脅時刻存在，目前養(yǎng)殖場主要是將病料送專業(yè)檢測實驗室進行病原分離鑒定或PCR檢測，一旦出現疫情，由于條件所限，很難實現對疫病的快速檢測。環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、煩瑣的電泳和紫外觀察等過程，整個反應在恒溫條件下進行，反應結束后，結果可用肉眼直接觀察，在疫病診斷領域顯示了廣闊的應用前景，筆者就LAMP技術及其在鴨病病原檢測中的應用研究進展綜述如下。

1　LAMP技術

1.1LAMP擴增原理

LAMP技術是針對靶基因6個區(qū)域設計4條特殊引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右溫度下，啟動循環(huán)鏈置換反應，完成對目標DNA的大量擴增。在LAMP反應中，內引物雜交在目標DNA區(qū)，啟動互補鏈合成，導致啞鈴狀DNA產生。這種結構很快以自身為板，進行DNA合成延伸，形成莖-環(huán)DNA結構，然后以此結構作為LAMP循環(huán)的起始結構。由于內引物雜交在莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成的DNA產生一個有缺口的莖-環(huán)DNA中間媒介，在莖上附有目標序列。再通過外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結構，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環(huán)的花椰菜結構的莖-環(huán)DNA混合物。

1.2LAMP引物設計

首先在靶基因的3’末端設定F3c、F2c、F1c三個區(qū)段，在5’末端設定B1、B2、B3三個區(qū)段。針對這六個區(qū)段設計四條引物，包括一對內部引物和一對外部引物。上游內部引物FIP：在3‘末端含有與F2c互補的F2區(qū)段，在5’末端含有與F1c相同序列的區(qū)段下游內部引物BIP：在3‘末端含有與B2c互補的B2區(qū)段，在5’末端含有與B1c相同序列的區(qū)段。上游外部引物F3：含有與目標DNA上的F3序列相同的區(qū)段。下游外部引物B3：含有與目標DNA的B3相同序列的區(qū)段。引物的設計要注意以下幾個問題：擴增領域為F2-B2區(qū)段間，應該在200bp以內；包含F2/B2在內的環(huán)狀部分的長度在40～60bp范圍內；各區(qū)段的Tm值應該在60～65℃之間；若只是為了鑒定靶基因存在與否，F1-B1的間距可以為零；引物應避免二次結構發(fā)生；各引物的3‘端不可含有與其他引物互補的序列。

1.3LAMP技術特點

LAMP技術特點具有以下特點：①操作簡便、耗時短、成本低，擴增反應在等溫下持續(xù)進行，只需在恒溫水浴鍋中幾十分鐘即可完成，不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA的變性，適合在基層養(yǎng)殖場的推廣應用。②擴增的效率高，沒有PCR反應中溫模板的退火、復性過程，能滿足臨床病料樣本快速檢測的需要。③特異性高，由于是針對靶序列6個區(qū)域設計的4種特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高。針對六個區(qū)段使用四種不同的引物，可特異性擴增靶基因序列。④靈敏度高，檢測的敏感性是常規(guī)PCR的10倍。⑤僅使用一種鏈置換型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一種不耐熱的DNA聚合酶，因此必須在模板預變性以后再加樣。⑥擴增產物是在同一條DNA鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構。⑦當模板是RNA時，僅需加入逆轉錄酶即可與DNA一樣進行擴增。

1.4反應產物的檢測

LAMP反應產物的檢測方法：①以2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有典型的梯狀條帶泳判定結果。②以擴增產生的副產物焦磷酸鎂白色沉淀的產生用肉眼直接判斷擴增反應是否進行。③反應體系中加入SYBRGreenⅠ等染料，通過觀察擴增結果是否產生相應顏色來判定是否有目的片段擴增。④通過恒溫擴增微流控芯片實時觀察反應結果。⑤運用實時濁度儀監(jiān)測反應結果。

2　在鴨病毒病檢測中的應用

2.1鴨病毒性肝炎病毒檢測

鴨病毒性肝炎是由鴨病毒性肝炎病毒（DHV）引起的一種急性、高度致死性傳染病，主要危害1～3周齡雛鴨，死亡率高達90%～95%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經濟損失。該病于1945年首次在美國發(fā)現，隨后相繼在世界多數國家報道了該病的流行。DHV可分為I型、Ⅱ型和Ⅲ型3種血清型，其中I型（DHV-Ⅰ）為臨床上常發(fā)的血清型。謝麗基等［1］根據基因庫中DHVⅠ基因的保守序列，設計特異性LAMP引物，建立了DHVI的RT-LAMP可視化檢測方法。該方法的敏感性可達10fg，高于常規(guī)PCR方法100倍，全部反應可在1h內完成，可以通過肉眼觀察顏色直接判定結果，對其他鴨常見病原體的檢測結果均為陰性。胡成等［2］根據GenBank中登錄的DHV-IVPl基因的高度保守序列，設計了特異性的引物，建立了一種靈敏、特異、高效的可視化體外環(huán)介導等溫擴增方法。結果表明，該方法的靈敏性可達到10fg，是常規(guī)一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反應可以在1.0～1.5h內完成，并可以直接通過肉眼觀察頗色進行結果判定，該方法對其他鴨常見的病原體檢測結果全部為陰性。

2.2鴨坦布蘇病毒檢測

鴨坦布蘇病毒（DTMUV）可引起鴨的坦布蘇病，感染鴨群的發(fā)病率高達100%，死亡率在5%～15%，臨床表現為高熱、蛋鴨產蛋率嚴重下降、部分感染鴨拉綠色稀便并出現神經癥狀，病理剖檢主要表現為卵巢充血、出血、萎縮、壞死，卵泡破裂，心內膜出血，脾臟腫大，該病給養(yǎng)鴨業(yè)造成的經濟損失達數十億元［3］。張偉等［4］參考NCBI中已收錄的DTMUVE基因保守區(qū)域設計了6條引物，通過對反應體系中各組分和條件進行優(yōu)化，建立了DTMUVLAMP檢測體系，并應用熒光顯色劑（SYBRGreenⅠ和鈣黃綠素、錳離子）對擴增產物進行可視化判定。結果顯示，以SYBRGreenⅠ為染料，顯色敏感性為10copies/μl的病毒，比普通PCR高100倍，以鈣黃綠素和錳離子組合作為顯色劑，其顯色極限為1000copies/μl的病毒，雖低于SYBR GreenⅠ的顯色敏感性，但能有效地避免氣溶膠造成的空氣環(huán)境污染。董嘉文等［5］根據DTMUVE基因保守區(qū)域設計了一套引物，建立了檢測DTMUV的RT-LAMP方法，該法的最低檢測限可達7.8copies，其靈敏度是普通RT-PCR的100倍，對其他常見鴨源病毒核酸擴增結果均為陰性。

2.3鴨瘟病毒檢測

鴨瘟是由鴨瘟病毒（DPV）引起的鴨、鵝等水禽的敗血性、高度致死性傳染病，其特征為兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭頸腫大，是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的傳染病之一［6］，是OIE規(guī)定的B類傳染病，給世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大經濟損失。許宗麗等［7］根據GenBank中DPVUI6基因的保守序列設計一套特異性引物，并對反應條件進行優(yōu)化，建立DPV的LAMP可視化檢測方法。結果：建立的LAMP方法對其他鴨常見病原體無擴增反應，可通過肉眼觀察顏色直接判定結果，敏感性可達0.1fg，是常規(guī)PCR方法的100倍，擴增反應只需在常規(guī)水浴鍋中進行，可在1h內完成。張坤等［8］根據GenBank中登錄的DPV基因組序列，設計3對特異性的LAMP引物，經優(yōu)化反應體系，建立了LAMP快速檢測方法。結果表明，LAMP方法能夠在63℃恒溫下，1h內實現目的核酸的大量擴增。結果判定時只需要在擴增產物中加入SYBRGreenⅠ染料，就可以直接在可見光或紫外光下觀察顏色變化。該方法敏感性可達0.245μg/L，比普通PCR靈敏性高10倍，對DHV、H9N2亞型禽流感病毒、鴨副黏病毒、鴨源偏肺病毒等的核酸無交叉反應。

2.4鴨流感病毒檢測

禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的禽類一種急性、高度接觸性傳染病。主要侵害禽類的呼吸系統、神經系統及消化系統等。AIV根據糖蛋白血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）的不同分為16個HA亞型和10個NA亞型，理論上可形成160種不同的禽流感病毒亞型，且不同亞型的病毒基因組會發(fā)生片段重組，造成病毒變異。王辰雨等［9］參考AIV基質蛋白（M）基因設計了兩對引物，特異性識別其6個不同位點，建立了基于顏色判定的LAMP方法。試驗對不同禽源病毒進行了測試，結果發(fā)現該方法僅特異性地檢出禽流感病毒（H9和H5亞型）核酸，對AIV病毒的檢測極限為10EID50。石霖等［10］針對AIVM基因設計了4個不同區(qū)段的特異性引物，并對反應條件和反應體系進行優(yōu)化，建立了AIV的RT-LAMP方法。結果表明，該方法對AIVH1-H16亞型的檢測結果均為陽性，而對其他禽類病毒的擴增均為陰性，具有良好的特異性。對AIV的最低檢測限為13.43EID50/ml，靈敏度為普通一步RT-PCR的10倍，擴增反應可以在恒溫水浴內60min內完成，在反應體系中添加熒光染料后，肉眼即可判定檢測結果。該檢測方法與RT-PCR方法和熒光定量RT-PCR方法對臨床樣品檢測的符合率均為81.8%。

2.5鴨細小病毒檢測

番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒（MPV）引起急性傳染病。該病主要危害3周齡內雛番鴨，病鴨臨床表現為張口呼吸、喘氣，消瘦、拒食、蹲伏，病例表現為十二指腸內容物呈松散栓子狀，表層有脫落的黏膜附著，胰臟呈點狀壞死，死亡率可達80%以上［11］，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)中危害最嚴重的傳染病之一。謝麗基等［12］根據GenBank登錄的MDPV基因的保守序列，設計一套特異性LAMP引物，建立了MDPV的LAMP可視化檢測方法。該方法的敏感性可達10fg，高于常規(guī)PCR方法10倍，全部反應可在1h內完成，可通過肉眼觀察顏色直接判定結果，對其他鴨常見病原體的檢測結果均為陰性。

2.6鴨新城疫病毒檢測

新城疫是一種由新城疫病毒引起的急性、高度傳染性病，是禽類養(yǎng)殖中的重要疫病之一，在世界各地廣發(fā)流行，各日齡鴨均可感染新城疫病毒發(fā)病，雛鴨最為嚴重，死亡率可達100%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經濟損失.鞠小軍等［13］選取鴨源新城疫病毒NP基因的相對保守區(qū)序列，利用PrimerExplorerV4在線軟件設計了3對RT-LAMP引物，建立鴨源新城疫病毒RT-LAMP快速檢測方法。結果顯示，該法能夠在63℃下1h內實現目標核酸區(qū)段的大量擴增，反應結果可直接用肉眼判斷，特異性強，靈敏度高，與其他病毒，如H9N2亞型AIV、鴨呼腸孤病毒（DRV）、禽偏肺病毒、傳染性支氣管炎病毒等的核酸無交叉反應，可檢測到1×10-3稀釋度的目標RNA（0.1pg/ml），較普通RT-PCR的靈敏性高10倍。

2.7鴨圓環(huán)病毒檢測

鴨圓環(huán)病毒是近年來新發(fā)現的病毒之一，主要臨床表現為生長遲緩、羽毛凌亂、體質量減輕等癥狀，更重要的是可感染禽類的免疫系統，引起免疫抑制。趙光遠等［14］根據GenBank中鴨圓環(huán)病毒基因序列，在保守區(qū)設計了6條特異性引物，并對反應條件進行優(yōu)化，建立了一種適用于鴨圓環(huán)病毒的LAMP檢測方法。該方法對H9亞型AIV、小鵝瘟、DPV、DHV、鴨副黏病毒均無擴增反應，且擴增反應只需在常規(guī)水浴鍋中進行，1h內即可完成反應，對鴨圓環(huán)病毒模版DNA的最小檢測限為10fg，靈敏度是一步法PCR的1000倍。

2.8鴨呼腸孤病毒檢測

引起鴨發(fā)病的呼腸孤病毒有新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）和番鴨呼腸孤病毒（MDRV），鴨感染后主要臨床表現為軟腳、腹瀉等，有的能夠引起高達98%的死亡率，病理變化則主要以肝、脾灰白色局灶性壞死為特征［15］。馬利等［16］建立了一種基于熒光顯色的禽呼腸孤病毒LAMP檢測方法。該檢測方法使用針對禽呼腸孤病毒的p10基因8個區(qū)域的6條LAMP引物，能夠在63℃恒溫條件下1h內完成反應，具有良好的敏感性和特異性，最低能夠檢出102個拷貝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而對其他病毒檢測結果為陰性。在熒光顯色中分別應用SYBR GreenⅠ和鈣黃綠素作為顯色劑，其結果與瓊脂糖凝膠電泳一致。于可響等［17］建立適于基層實驗室快速檢測NDRV的一步RT-LAMP方法?；谛滦网喓裟c孤病毒S3基因的6個保守區(qū)域設計了4條LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒溫保持45min即可完成反轉錄和擴增反應，由此建立了RT-LAMP檢測方法。該方法具有良好的特異性，除NDRV外對其他6種常見鴨病的檢測結果均為陰性。該方法對病毒RNA的最低檢出量為0.1pg，是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

3　在鴨細菌病檢測中的應用

3.1鴨疫里默氏桿菌檢測

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌感染引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合征、鴨疫巴氏桿菌病等。該病主要侵害鴨等水禽類動物，臨床表現主要為神經癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎，2-7周齡雛鴨受到的危害最嚴重，發(fā)病率可達90%以上，死亡率高達75%以上，給養(yǎng)鴨造成了嚴重的經濟損失［18］。吳彤等［19］根據鴨疫里默氏菌16SrRNA基因設計引物，在建立了檢測鴨疫里默氏菌的LAMP方法，該法在63℃60min即能完成反應，通過監(jiān)測反應液濁度判斷結果。在此基礎上，用煮沸10min的方法代替試劑盒提取DNA方法，并用顯色方法代替濁度檢測和瓊脂糖凝電泳方法判斷結果，通過敏感性、特異性、病原消長規(guī)律試驗驗證方法的準確性。結果顯示，顯色法、濁度檢測和瓊脂糖凝電泳方法判斷結果的敏感性和特異性相同。細菌分離法共獲得201株鴨疫里默氏菌，且經LAMP與PCR法檢測均呈陽性，LAMP與PCR法檢出陽性樣本總數分別為271份和254份，LAMP方法陽性檢出率高于PCR方法。

3.2禽多殺性巴氏桿菌檢測

禽霍亂是一種由禽多殺性巴氏桿菌引起家禽和野禽發(fā)病死亡的接觸性傳染病，常表現為敗血型，發(fā)病率和死亡率都很高，但有時表現為慢性經過。早在18世紀歐洲各地的禽類就常發(fā)生此病，目前該病在世界大多數國家都有分布，呈散發(fā)性或流行性，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經濟損失，多年來一直都被國內外學者所重視，被列為重點防治的家禽疫病之一。

4　小結

LAMP技術作為一種快速基因擴增技術，自發(fā)明以來，在國內外疾病、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個領域都取得了重大成就，近年來受到了越來越多的關注，LAMP是整個過程均在恒溫條件下進行，不需要昂重儀器設備，而易在基層部門普及的檢測技術，避免了常規(guī)PCR對于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來的各種不便，可快速、準確地做出傳染性病病原學診斷，從而及時有效控制疫情，使養(yǎng)殖場損失降到最低。但LAMP檢測技術同樣存在一些不足，一是LAMP對于引物設計要求很高，需要設計的引物數目多，結構復雜。二是檢測靈敏度太高，易因空氣中的氣溶膠污染而產生假陽性結果。三是在LAMP擴增結果判定方面也存在一定的問題，當以瓊脂糖凝膠電泳法法判定結果時，結果為梯形條帶，不易鑒別非特異性擴增。當焦磷酸鎂白色沉淀和體系中添加染料法判定結果時，可能存在因結果顏色不明顯而造成肉眼觀察不便捷及誤判，另外，當有非特異擴增時，染料也可結合，影響結果判定。當微流控芯片和實時濁度儀法判定結果時，則需要購置昂貴的分析儀器，隨著研究的不斷深入，研究人員還將其原位雜交、免疫捕獲、核酸雜交等技術進行聯合，開發(fā)了很多有效的檢測方法，尤其是將環(huán)介導橫溫擴增與橫向流動試紙條技術結合，發(fā)展起來的新的將環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）與橫向流動試紙條（LFD）聯合應用，建立一種新的病原快速檢測技術，即LAMP-LFD技術。使得LAMP現場檢測結果的觀察更加方便、直觀和準確。并解決了擴增產物形成氣溶膠污染環(huán)境，導致樣品間交叉污染的問題，開啟了基因檢測技術步入了基層養(yǎng)殖場的應用新時代，極具推廣前景。目前已經有科研人員在CSFV的檢測方面［20］進行了一些探索，并取得了一定的成績，筆者認為這將是LAMP-LFD技術是未來LAMP檢測技術將來的發(fā)展的方向，在一些基層實驗室和流行病學調查等領域具有廣闊的應用前景。

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