侯月娥，伍建敏，王鳳求，趙玉林，張 杰，王貴平，李中圣

( 廣東海大集團股份有限公司，廣東 廣州 511400 )

草魚呼腸孤病毒(Crasscarpreovirus，GCRV)是我國研究人員于1983年分離出的一株草魚出血病病毒，經(jīng)研究后按照其在形態(tài)學和理化特性等方面的特征最終鑒定[1]。草魚呼腸孤病毒是水生動物呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)中毒力、傳染性、致病性均較強的病毒，暴發(fā)高峰期可引起高達90%的死亡率，病魚以體表充血、出血為主要癥狀，口腔、眼部、鰓、肝、脾、腎等器官和組織也可見不同程度的充血、出血現(xiàn)象，給我國的草魚(Ctenopharyngodonidellus)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。該病毒病原學復雜、毒株變異大。曾偉偉等[2]根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的草魚呼腸孤病毒序列，將其分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。至今，已報道的分離株有30余株，通過對近5年提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中的草魚呼腸孤病毒基因序列進行分析和比較后發(fā)現(xiàn)，19個草魚呼腸孤病毒新分離株中的16株為Ⅱ型，占整個草魚呼腸孤病毒新分離株的84%，可見草魚呼腸孤病毒Ⅱ型毒株為當前流行株[3-11]。

草魚呼腸孤病毒診斷方法主要為免疫學診斷，如葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗法[12]、熒光抗體技術和酶聯(lián)免疫吸附試驗法[13]、斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗法[14]；電鏡觀察也常用于草魚呼腸孤病毒病毒病的診斷[15]。草魚呼腸孤病毒免疫學診斷法在基層檢測機構中使用頻率較高、特異性好，但操作復雜，對檢測人員的專業(yè)性要求較高。實驗室中針對草魚呼腸孤病毒核酸的RT-PCR檢測是普遍使用的檢測手段[16]，可有效區(qū)分不同基因型草魚呼腸孤病毒。本研究首先建立了草魚呼腸孤病毒Ⅱ型熒光定量PCR檢測法，在此基礎上，通過將檢測試劑整體凍干，制備了一種可常溫長期保存、快速檢測的核酸檢測法，該方法適合草魚呼腸孤病毒Ⅱ型的快速檢測和流行病學調查，為草魚呼腸孤病毒預防和控制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株及質粒

草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒(Springviremiaofcarpvirus, SVCV)、傳染性造血器官壞死癥病毒(Infectioushematopoieticnecrosisvirus, IHNV)均由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司惠贈。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和pMD18TM-T載體購自TaKaRa公司。

1.2 主要試劑和儀器

體液病毒RNA小量制備試劑盒(Axygen公司)；RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉錄酶(Promega公司)；dNTP(TaKaRa公司)；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、普通質粒小量提取試劑盒(Omega公司)；NeuM凍干保護劑由廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院提供。CFX384Real-Time Systerm、S1000 Thermal Cycler(廣東昊洋貿易有限公司)；核酸蛋白檢測儀(Thermo)(廣東東銳儀器設備有限公司)；Triad冷凍干燥器(照生有限公司)。

1.3 引物和探針的設計及合成

根據(jù)草魚呼腸孤病毒(GQ896337)的核酸序列，利用Beacon Designer 7設計軟件，設計特異性引物和熒光探針(表1)，引物和探針由上海Invitrogen公司合成。

表1 草魚呼腸孤病毒的熒光定量RT-PCR探針及擴增引物

1.4 草魚呼腸孤病毒總核酸的提取及模板的制備

參照病毒RNA小量制備試劑盒說明書提取病毒傳代細胞中的總核酸。取草魚呼腸孤病毒的總RNA部分反轉錄為cDNA，并置于超低溫冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 草魚呼腸孤病毒基因片段克隆及標準品的制備

分別以草魚呼腸孤病毒的cDNA為模板，GCRV-F/GCRV-R (10 pmol/L)為引物進行PCR擴增。擴增條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 6 min。PCR擴增產物采用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。將切膠純化的PCR產物分別克隆至pMD-18T載體中，構建重組質粒pMD-GCRV，將陽性的重組質粒測序鑒定[17]。并采用thermo核酸蛋白檢測儀測定重組質粒密度，換算成個數(shù)。

1.6 TaqMan熒光定量RT-PCR擴增反應條件的優(yōu)化

調節(jié)草魚呼腸孤病毒的引物和探針終濃度為0.1～0.6 μmol/L，反轉錄時間5～15 min，退火溫度55～65 ℃，不同濃度配比、反轉錄時間和退火溫度單獨進行熒光定量RT-PCR反應優(yōu)化，選擇其中結果最好的引物、探針濃度、反轉錄時間及退火溫度。

1.7 反應試劑凍干品的制備

1.7.1 凍干保護劑的優(yōu)化

將凍干保護劑稀釋為4組不同的濃度(10、8、5、1.25 μmol/mL)同配制好的反應試劑混勻然后進行無菌分裝，200 μL八連管每管加入100 μL反應液(相當于20 μL的反應體系)。分裝后放于-80 ℃冰箱冷凍3 h，當完全凍好以后，開蓋放于已經(jīng)調試好的Triad冷凍干燥器里進行冷凍干燥。冷凍程序為：-35 ℃ 3 h，-20 ℃ 1 h，-15 ℃ 1 h，0 ℃ 3 h，25 ℃ 1 h。程序停止以后根據(jù)凍干樣品物理性狀選擇最佳的一組。

1.7.2 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑的使用方法

將凍干試劑用滅菌的去離子水16 μL進行溶解，加入2 μL的陽性對照品，同時用滅菌的去離子水作為陰性對照，每管20 μL，封蓋混勻離心。熒光定量RT-PCR的反應條件均為：42 ℃ 5 min，95 ℃預變性1 min，95 ℃變性10 s，退火溫度為RT-PCR擴增反應條件優(yōu)化的最適溫度，40個循環(huán)，每個循環(huán)結束時進行熒光信號采集。

1.8 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑標準曲線的構建

將制備的草魚呼腸孤病毒標準品作10倍系列稀釋，用不同稀釋梯度的重組質粒作為模板，每個梯度的質粒設立3個重復。用優(yōu)化的反應體系進行實時熒光定量RT-PCR擴增。熒光定量RT-PCR的反應條件均為：42 ℃ 5 min，95 ℃預變性1 min，95 ℃變性10 s，退火溫度為RT-PCR擴增反應條件優(yōu)化的最適溫度，40個循環(huán)，每個循環(huán)結束時進行熒光信號采集。

1.9 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑特異性、敏感性和穩(wěn)定性試驗

1.9.1 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑特異性試驗

將提取的草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒核酸作為模板進行RT-PCR擴增，驗證其特異性。

1.9.2 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑敏感性試驗

將測定好質粒密度的模板進行10倍系列稀釋，利用草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑測定其敏感性。與本試驗室已經(jīng)建立草魚呼腸孤病毒普通PCR進行檢測，比較其敏感性。

1.9.3 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑穩(wěn)定性試驗

自已經(jīng)稀釋好的質粒樣品中選取密度為1×106個/μL為模板，對抽取的6個批次的草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑進行試驗，計算其Ct值的標準差和變異系數(shù)，驗證其穩(wěn)定性。

1.10 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑保存期試驗

將凍干檢測試劑分別放置于室溫25 ℃和37 ℃保存，定期進行其敏感性檢測，考察不同保存條件下的敏感性。

1.11 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑在手持式熒光PCR儀上的試驗

手持式熒光PCR儀為單通道PCR儀，將1.5制備的草魚呼腸孤病毒標準品做10倍系列稀釋，用不同稀釋梯度的重組質粒作為模板，根據(jù)其已有內置程序進行熒光PCR擴增，收集熒光信號進行定性檢測，42 min可以看到結果。

1.12 臨床樣本的檢測試驗

選取經(jīng)過檢測驗證的草魚呼腸孤病毒陽性樣品20份、草魚呼腸孤病毒可疑的樣品13份，未經(jīng)驗證的樣品27份累計60份，樣品均來自廣東地區(qū)，采用本次構建的一步法凍干檢測試劑進行臨床樣品驗證。

2 結 果

2.1 重組質粒標準品的制備

以草魚呼腸孤病毒合成的引物進行RT-PCR擴增，擴增產物采用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。將切膠純化的PCR產物分別與pMD-18T載體連接，構建重組質粒pMD-GCRV，將陽性的重組質粒測序鑒定。結果顯示，草魚呼腸孤病毒引物能擴增出相應的目的片段(圖1)。

圖1 草魚呼腸孤病毒陽性重組質粒鑒定結果1：草魚呼腸孤病毒；M：DL2000 Marker.

2.2 熒光定量RT-PCR擴增反應條件優(yōu)化

引物、探針終濃度的不同配比、不同的退火時間以及不同退火溫度試驗結果顯示，引物、探針的不同終濃度和不同的退火溫度都會引起Ct值的不同，而反轉錄時間5 min和15 min對Ct值沒有影響，GCRV-F/GCRV-R引物的終濃度0.2 μmol/L、探針終濃度為0.3 μmol/L、反應條件退火溫度為60 ℃時，對同一標準品的檢測信號值最強，Ct值最小(圖2～圖3)。

圖2 草魚呼腸孤病毒引物濃度優(yōu)化1：引物濃度0.2 μmol/L；2：引物濃度0.25 μmol/L；3：引物濃度0.3 μmol/L.

圖3 草魚呼腸孤病毒退火溫度優(yōu)化a:退火溫度60 ℃；b:退火溫度55 ℃.

2.3 草魚呼腸孤病毒凍干保護劑的優(yōu)化

優(yōu)化試驗結果顯示，保護劑濃度達到8 μmol/mL時的Ct值與不加保護劑的反應相同(圖4)，且該組的凍干形態(tài)也較好，凍干樣品致密，來回搖動不散開，加入DEPC水迅速溶解，故將保護劑濃度定為8 μmol/mL(圖5)。

圖4 草魚呼腸孤病毒凍干保護劑的優(yōu)化a:不加保護劑；b:8 μmol/mL保護劑；c:10 μmol/mL保護劑；d:5 μmol/mL保護劑；e:1.25 μmol/mL保護劑.

圖5 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑的凍干后的物理性狀

2.4 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑標準曲線構建

草魚呼腸孤病毒的熒光定量PCR反應標準品，質粒密度梯度為1×101～1×106個/μL的6個線性梯度的檢測標準曲線呈等距性和平行性，具有較好的梯度性(圖6)。

圖6 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑標準曲線

2.5 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑特異性、敏感性和穩(wěn)定性試驗

2.5.1 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑特異性試驗

將提取的草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒核酸作為模板進行RT-PCR擴增，結果顯示，僅有草魚呼腸孤病毒的熒光信號為陽性，其他兩種病毒的檢測均為陰性，說明構建的草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑的特異性較強，與其他病毒的基因無交叉反應(圖7)。

圖7 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑的特異性試驗GCRV為草魚呼腸孤病毒，SVCV為鯉春病毒血癥病毒，IHNV為傳染性造血器官壞死癥病毒.

2.5.2 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑敏感性試驗

通過對草魚呼腸孤病毒的反應標準重組質粒進行系列稀釋，結果顯示，對草魚呼腸孤病毒的擴增效率較好，實時熒光定量RT-PCR的最低檢測量為101個/μL(圖8)。與實驗室已經(jīng)構建的草魚呼腸孤病毒普通PCR檢測結果進行比較，是普通PCR敏感性的100倍(圖9)。

圖8 草魚呼腸孤病毒 凍干檢測試劑敏感性試驗a～f曲線分別為草魚呼腸孤病毒質粒密度1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101 個/μL.

圖9 普通草魚呼腸孤病毒標準品敏感性試驗1～6分別為草魚呼腸孤病毒質粒密度1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101 個/μL；M:DL2000 Marker.

2.5.3 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑穩(wěn)定性試驗

選取稀釋好的標準品質粒密度為1×106個/μL為模板，對抽取的6個批次的草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑進行試驗，結果顯示，6個批次間的變異系數(shù)為3.6%(表2)，驗證了該凍干試劑具有良好的穩(wěn)定性。

表2 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑熒光定量RT-PCR穩(wěn)定性試驗

2.6 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑保存期試驗

試驗結果顯示，凍干試劑分別在25 ℃ 180 d、37 ℃ 15 d與對照試劑(0 d樣品)檢測結果無差異，敏感性均可以達到10個(表3)，由此說明，草魚呼腸孤病毒的凍干檢測試劑在這兩種存放條件下的敏感性并未降低，質量穩(wěn)定。

表3 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑不同保存條件下的敏感性試驗(Ct值)

2.7 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑PCR敏感性

草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑在手持式熒光PCR儀和熒光定量PCR儀上的敏感性比對結果見表4。

表4 草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑不同PCR試驗敏感性比對(Ct值)

2.8 臨床樣品檢測結果

對20份普通PCR鑒定的已知臨床病料和13份可疑臨床病料以及未知的27份病料進行檢測，結果顯示，20份陽性病料，病毒密度為2.3×103～6.4×107個/μL(超過以及等于106個/μL的樣品，均稀釋100后再次檢測)，符合率為100%；13份可疑病料檢測結果顯示，5份感染草魚呼腸孤病毒，病毒密度為1.0×102～3.1×103個/μL，陽性率為38.46%。27份未驗證病料的檢測結果顯示，陽性感染的有7份，病毒密度為4.3×102～5.1×108個/μL，感染率為25.93%，而普通PCR僅檢測出3份，感染率為11.11%。

3 討 論

草魚呼腸孤病毒是危害草魚魚苗階段的一種病毒性魚病，目前我國針對預防草魚呼腸孤病毒的疫苗如組織滅活疫苗、細胞滅活疫苗、細胞弱毒疫苗以及基因工程亞單位疫苗均有小范圍使用，也取得了不錯的效果，但是仍然無法對草魚呼腸孤病毒進行有效控制，每年都會給養(yǎng)殖戶造成較大的損失。因此對該病的快速、準確、定性、定量以及便捷的檢測就顯得尤為重要。

本研究建立的一步法凍干檢測試劑檢測方法，是利用探針設計和引物設計的兩種軟件相互驗證[18]，并對體系中引物、探針、酶、反應液鹽濃度等條件進行了反復篩選調整和優(yōu)化，最終確定了一個最佳檢測反應條件。在此優(yōu)化的基礎上將除核酸以外的所有成份(含保護劑)進行優(yōu)化，添加在八連管中，分裝后放于-80 ℃冰箱冷凍3 h，當完全凍好以后，開蓋放于已經(jīng)調試好的Triad冷凍干燥器里進行冷凍干燥，最終確定了對反應無影響的保護劑組合和凍干條件。干燥好的凍干檢測試劑可以常溫運輸和短時間保存，均不會影響其性能，省去了各種試劑的混合和條件摸索以及在冰盒上的操作，也降低了對工作人員的專業(yè)要求。直接用DEPC水進行溶解添加所需檢測的RNA，置于熒光定量PCR儀，通過分析軟件能直觀詳細記錄整個RT-PCR過程，無需再置備熒光定量專用的離心管，進行反轉錄以及瓊脂糖凝膠電泳，利用標準曲線，可以直接從軟件上得到病毒的準確密度。有效減少假陽性和污染發(fā)生的機會，步驟簡單快捷。

草魚呼腸孤病毒一步法凍干檢測試劑的特異性結果顯示，將提取的草魚呼腸孤病毒、鯉春病毒血癥病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒核酸RNA為模板進行試驗，僅有目的曲線擴增，其余均為陰性，說明其具有良好的特異性；敏感性試驗的結果顯示，其敏感性可達到101個/μL，r2>99.9%，具有較好的標準曲線和線性關系；6個批次間的變異系數(shù)為3.6%，穩(wěn)定性較好；與常規(guī)的RT-PCR反應方法比較，是普通RT-PCR敏感性的100倍。周勇等[19]建立的草魚呼腸孤病毒熒光定量檢測方法特異性和敏感性均較好，但是操作繁瑣，試劑必須低溫保存，不方便運輸，不能普及。而本研究的草魚呼腸孤病毒凍干檢測試劑可以在常溫操作而不影響其敏感性，也可以利用手持式熒光PCR儀，將樣品放置好，42 min就可以判定是否感染。彌補了傳統(tǒng)檢測方法重復性和耗時長的不足，同時具有較高的特異性，可以避免臨床樣品中其他病原的干擾。這對于草魚出血病的早期診斷、病毒定量檢測、致病機理研究以及防控技術研究等且有重要意義。