徐 囡，吳長德，張英俊，常靈竹

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

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豬血凝性腦脊髓炎研究進(jìn)展

徐 囡，吳長德，張英俊，常靈竹*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

豬血凝性腦脊髓炎(PHE)是由血凝性腦脊髓炎病毒(HEV)感染引起豬的一種急性傳染病，主要侵害1周齡～3周齡的哺乳仔豬。感染仔豬以嘔吐、衰竭和神經(jīng)癥狀為特征，病死率很高。血凝性腦脊髓炎病毒具有嗜神經(jīng)性，主要從感染部位經(jīng)外周神經(jīng)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳播，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，從而造成非化膿性腦炎的病變。論文主要對豬血凝性腦脊髓炎的病原、臨床癥狀和病理變化、致病機(jī)制、潛在危害及防治等方面進(jìn)行綜述。

豬血凝性腦脊髓炎；致病機(jī)制；病理變化

豬血凝性腦脊髓炎(porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE)是仔豬的一種急性、高度接觸性傳染病，其病原是豬血凝性腦脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus，HEV)，主要侵害1周齡～3周齡哺乳仔豬，以嘔吐、衰竭和明顯的神經(jīng)癥狀為主要特征，病死率高達(dá)90%以上。該病1958年在加拿大首次暴發(fā)[1]，1962年HEV從患腦脊髓炎的哺乳仔豬中被分離出來[2]。該病1984年在北京某豬場首次出現(xiàn)[3]，以后國內(nèi)多省市報道該病的發(fā)生。近年來，血清學(xué)調(diào)查顯示，HEV的隱性感染在我國多個省份的成年豬群中普遍存在[4]，隱性感染豬臨床上無特異性癥狀，但會出現(xiàn)消瘦和發(fā)育不良，導(dǎo)致生產(chǎn)性能和肉產(chǎn)品質(zhì)量的下降。該病原的隱性傳播，會發(fā)生基因變異及毒力增強(qiáng)，引發(fā)疾病的流行，該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害不容忽視。

1 病原

HEV是一個正向不分段的單股RNA冠狀病毒，為冠狀病毒科冠狀病毒屬成員。該病毒粒子呈一個球形，在這個球形的最中心有一個球心，被一層外囊膜以及一層內(nèi)囊膜組成的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹著。病毒粒子的直徑為 100 nm～150 nm，最中間球心的直徑為 70 nm～130 nm。HEV主要有5種結(jié)構(gòu)蛋白：血凝素-酯酶蛋白(HE)、纖突蛋白 (S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白 (M) 和核衣殼蛋白(N)，占到整個基因組的三分之一，它們從5′到3′端按照HE-S-E-M-N的順序進(jìn)行排列[5]。

HEV對熱敏感, 56℃ 5 min即被滅活,在37℃只能存活24 h。但在低溫和凍干組織培養(yǎng)物中非常穩(wěn)定，在冰凍狀態(tài)下存活1年以上，在含毒培養(yǎng)液的低壓凍干制品長年不喪失感染力。豬是HEV的自然宿主，通過試驗(yàn)性接種傳代，病毒已適應(yīng)在小鼠體內(nèi)復(fù)制。HEV能在小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞、豬腎細(xì)胞系(PK-15)、小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系(N2a)、巨噬細(xì)胞系(J774A.1)[6]等培養(yǎng)物中增殖。

2 臨床癥狀與病理變化

2.1 臨床癥狀

2.1.1 神經(jīng)型 通常4日齡～7日齡的仔豬發(fā)病，主要出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。起初，發(fā)病仔豬全身肌肉震顫，角弓反張，四肢呈游泳狀劃動，倒退行走。發(fā)病后期，仔豬虛弱、不能站立，常呈犬坐姿勢。有些仔豬出現(xiàn)眼球震顫、失明等。發(fā)病仔豬多表現(xiàn)食欲廢絕，常以死亡告終。

2.1.2 嘔吐消耗型 發(fā)病初期仔豬吃奶后，常表現(xiàn)嘔吐癥狀，病重時不喜吃奶。長時間嘔吐和攝食減少導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重脫水。仔豬發(fā)病后期表現(xiàn)為呼吸困難，皮膚及可視黏膜發(fā)紺，最后陷入昏迷狀態(tài)而死亡。

2.2 病理變化

該病主要以非化膿性腦炎病變?yōu)樘卣?。剖檢時腦膜充血，大腦皮質(zhì)部充血、淤血。腦脊液增多，腦脊髓膜及實(shí)質(zhì)內(nèi)散在暗紅色小點(diǎn)。顯微鏡觀察，腦部神經(jīng)細(xì)胞變性、血管周圍形成以單核細(xì)胞浸潤為主的血管套以及膠質(zhì)細(xì)胞增生性結(jié)節(jié)。

3 致病機(jī)制

HEV具有嗜神經(jīng)性，在侵入部位的局部復(fù)制后，經(jīng)外周神經(jīng)向中樞神經(jīng)傳播，引起宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，尤其是腦部的損傷，出現(xiàn)大腦神經(jīng)細(xì)胞的變性，及大腦非化膿性腦炎。近年來對HEV的致病機(jī)制的研究主要從分子病理學(xué)和免疫病理學(xué)角度進(jìn)行，研究病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制及增殖，以及宿主對病毒感染的應(yīng)答反應(yīng)。

3.1 HEV在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制

病毒要想在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、增殖，需要先吸附到宿主細(xì)胞上，與細(xì)胞上的病毒受體結(jié)合，侵入細(xì)胞內(nèi)。冠狀病毒的S蛋白在病毒入侵和感染細(xì)胞過程中起到了非常重要的作用[7]，可介導(dǎo)病毒顆粒-靶細(xì)胞的結(jié)合及病毒-細(xì)胞膜的融合，使病毒侵入細(xì)胞，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。HEV的復(fù)制也開始于S蛋白的受體結(jié)合域與敏感細(xì)胞受體的結(jié)合，如S蛋白可與神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(nerve cell adhesion molecue,NCAM)特異性結(jié)合，推測NCAM可能是HEV的受體[8]，S蛋白的受體結(jié)合域?yàn)榈?291-548 位氨基酸[9]。同一種病毒常有多種細(xì)胞受體，HEV的受體蛋白可能不會只有NCAM一種。通過免疫共沉淀的方法從N2a的細(xì)胞膜蛋白中得到了一種疑似HEV受體的蛋白，利用質(zhì)譜技術(shù)分析出該蛋白可能是丙酮酸激酶[10]。HEV通過病毒受體吸附到宿主細(xì)胞上后經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，再通過胞吐和胞吞作用在神經(jīng)元間進(jìn)行跨突觸傳遞[11]。HEV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制需多種病毒基因的參與。為了研究參與HEV復(fù)制的相關(guān)基因，蘭云剛等[12-14]用RNAi技術(shù)分別對HEV的S基因、N基因、R基因進(jìn)行沉默，結(jié)果均阻斷了HEV的復(fù)制，說明S基因、N基因和R基因均是病毒復(fù)制的關(guān)鍵基因，它們都含有HEV復(fù)制的必需位點(diǎn) 。HEV在宿主細(xì)胞內(nèi)的大量復(fù)制，可引起宿主細(xì)胞(PK-15細(xì)胞和N2a 細(xì)胞)的凋亡，但病毒的復(fù)制增殖并不依賴于細(xì)胞凋亡[15-16]。

3.2 HEV感染后機(jī)體的應(yīng)答反應(yīng)

3.2.1 宿主的免疫應(yīng)答 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)是參與天然免疫應(yīng)答非常重要的抗原提呈細(xì)胞，能捕獲、處理、遞呈抗原，激活T細(xì)胞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了研究HEV感染初期DC的抗原遞呈作用，趙家寬[17]用HEV體外感染小鼠DC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞共刺激分子CD 40、CD 80及MHCⅡ均有一定程度的上調(diào)，同時DC分泌細(xì)胞因子和趨化因子的能力顯著增強(qiáng)，說明HEV感染后有效地活化了DC，具有潛在激活T、B淋巴細(xì)胞的能力。研究證明，小鼠感染HEV后體液和細(xì)胞免疫均會增強(qiáng)，感染初期，以體液免疫為主，感染后期以細(xì)胞免疫為主[18]。機(jī)體的免疫系統(tǒng)通過細(xì)胞免疫和體液免疫可抵抗入侵的病原，清除突變細(xì)胞，維持自身的穩(wěn)態(tài)。但過高的免疫反應(yīng)往往會引起組織損傷，如HEV感染后，腦部呈現(xiàn)出非化膿性腦炎的變化，其中小膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)。唐志文等[19]發(fā)現(xiàn)，HEV感染后小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增殖、活化，可分泌多種細(xì)胞因子(如IL-1、IL-2、TNF-α)、趨化因子 (如CXCL2、CXCL10、CCL2)、氧自由基和NO等，并表達(dá)多種免疫相關(guān)因子，如MHC類抗原、CD抗原和黏附分子等，正是這些因子發(fā)揮的免疫作用介導(dǎo)了神經(jīng)系統(tǒng)的炎性損傷。

3.2.2 宿主細(xì)胞差異基因和mi RNA的表達(dá) 小鼠感染HEV后大腦皮質(zhì)出現(xiàn)多種差異miRNA和差異基因的表達(dá)[15]，對差異miRNA及相關(guān)差異基因進(jìn)行Pathway分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因和差異miRNA在HEV致宿主免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)功能紊亂中起著重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步研究這些基因的差異表達(dá)調(diào)控機(jī)制，能夠更加深入的揭示HEV致宿主損傷的機(jī)制及宿主免疫應(yīng)答機(jī)制。

4 病原檢測與診斷

4.1 病毒分離

無菌采取病豬的大腦或脊髓，按常規(guī)方法制成接種材料。接種于PK-15細(xì)胞，37℃靜置培養(yǎng)，每日觀測是否有細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)[20]。

4.2 血凝試驗(yàn)

耿百成等[21]利用HEV凝集雞紅細(xì)胞的特征建立了血凝抑制試驗(yàn)，用于檢測組織和細(xì)胞中是否含有病毒。

4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

趙傳博等[22]用HEV單克隆抗體作為檢測抗體，豬多抗作為捕獲抗體，已成功建立特異、敏感的用于HEV檢測的抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法。

4.4 聚合酶鏈反應(yīng)

常靈竹等[23]建立了RT-PCR方法，可對感染HEV的小鼠和豬進(jìn)行檢測。丁寧[24]建立了HEV環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)方法，在60℃恒溫擴(kuò)增，僅需肉眼觀察是否產(chǎn)生白色沉淀即可判斷擴(kuò)增與否。

4.5 膠體金試紙快速診斷

陳克研等[25]用膠體金試紙可快速檢測HEV，其對試驗(yàn)條件要求極低，可在實(shí)驗(yàn)室外進(jìn)行使用，但其敏感性和特異性不如ELISA和PCR。

5 潛在危害及防治

由于冠狀病毒的高頻重組，強(qiáng)大的基因組獲得與結(jié)構(gòu)域丟失能力，造成了冠狀病毒的遺傳多樣性，增加了動物性疾病傳染給人的可能性。如果子貍感染的SARS-CoV和駱駝感染的中東呼吸綜合征病毒均傳染給人，造成了這兩種疾病的廣泛流行[26]。HEV作為冠狀病毒之一，也有基因組高頻重組的可能，成為人獸共患病的潛在危機(jī)。HEV除引起哺乳仔豬的高病死率外，在全國各地育肥豬中主要呈隱性感染，導(dǎo)致肉產(chǎn)品質(zhì)量的下降，對食品安全的潛在危險不容忽視。臨床上豬血凝性腦脊髓炎的防控既無特效藥，又無有效的預(yù)防措施。陳克研等[27]研制出滅活疫苗和DNA疫苗，對HEV的感染均可起到良好的保護(hù)效果，但這兩種疫苗仍處于試驗(yàn)階段。因此，應(yīng)加強(qiáng)豬血凝性腦脊髓炎疫苗和藥物的研發(fā)，早日研發(fā)出有效的疫苗和藥物。

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Progress on Porcine Hemagglutinating Encephalomyelitis

XU Nan, WU Chang-de, ZHANG Ying-jun, CHANG Ling-zhu

(ShenyangAgriculturalUinversity,Shenyang,Liaoning,110866,China)

Porcine hemagglutinating encephalomyelitis is an acute infectious disease caused by hemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV) infection,and mainly infracts 1-3 week old piglets.It causes encephalomyelitis, vomiting and wasting disease in suckling piglets.The mortality of HEV-infected piglets is very high.The hemagglutinating encephalomyelitis virus has the characteristics of neurotropism and mainly transmits from the infection site through the peripheral nerve to the central nervous system, causes the central nervous system damage, thus causes the pathological lesions of non purulent encephalitis.The pathogen, clinical symptoms,pathollgical lesions, potential hazards and prevention measures of porcine hemagglutinating encephalomyelitis were reviewed.

Porcine hemagglutinating encephalomyelitis; pathogenesis; pathology

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302057)

徐 囡(1992-)，女，遼寧鞍山人，碩士研究生，主要從事動物病理學(xué)研究。*通訊作者

S852.65

A

1007-5038(2016)11-0094-04