魏 勇，陳美琪，王 利*，肖 云, 于吉鋒，李興玉

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都，610066；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041;3.四川省大竹縣畜牧局，四川大竹 635100)

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豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌磺胺類耐藥基因型及表型分析

魏 勇1，陳美琪2，王 利2*，肖 云3, 于吉鋒1，李興玉1

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都，610066；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041;3.四川省大竹縣畜牧局，四川大竹 635100)

為了檢測(cè)豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥狀況，用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的藥敏紙片擴(kuò)散法檢測(cè)11株豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥性表型，用multi-PCR Kit檢測(cè)磺胺類藥物的耐藥基因(sul1,sul2,sul3)。結(jié)果表明,11株豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌對(duì)磺胺復(fù)合物的耐藥率為45%，磺胺二甲基惡唑耐藥率為45%,磺胺甲基惡唑耐藥率為64%?；前奉愃幬锏腟ul 1基因檢出率為100%，sul 2基因檢出率為90.9%，sul 3基因檢出率為36.4%，磺胺類抗生素耐藥基因的總檢出率為100%。研究結(jié)果可為大腸埃希菌的耐藥性研究以及磺胺類耐藥機(jī)制的研究提供科學(xué)依據(jù)。

豬場(chǎng)糞污；大腸埃希菌；磺胺類；耐藥基因

大腸埃希菌(E.coli)是人和動(dòng)物腸道中普遍存在的一類腸道共生菌，也是一種人獸共患的條件致病的革蘭陰性短桿菌。大腸埃希菌也是一種環(huán)境常在菌，但大腸埃希菌的出現(xiàn)通常與糞污密切相關(guān)，也通常作為環(huán)境樣品生物測(cè)試污染指示物[1]。大腸埃希菌也經(jīng)常作為抗菌素耐藥基因的貯存庫(kù)，在細(xì)菌耐藥性分析及耐藥基因傳遞研究方面起著非常重要的作用[2-3]。環(huán)境中細(xì)菌耐藥基因的消除情況也直接關(guān)系到人類醫(yī)療及動(dòng)物疫病防控過(guò)程中抗生素藥物的臨床應(yīng)用。近年來(lái)，隨著規(guī)模養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，大腸埃希菌等細(xì)菌病原對(duì)于動(dòng)物健康的危害日趨廣泛而復(fù)雜，這也就直接導(dǎo)致了抗菌藥物的大量使用，使細(xì)菌耐藥及耐藥基因傳遞逐漸成為廣泛關(guān)注的嚴(yán)峻問(wèn)題[4-8]，這給養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展埋下隱患，更為人與動(dòng)物疾病的預(yù)防及治療帶來(lái)了極大的危害。

磺胺類藥物是一類人工合成的抗菌藥物，它具有造價(jià)便宜，抑菌作用顯著，理化性質(zhì)穩(wěn)定，藥效持久，操作方便等諸多優(yōu)點(diǎn)。其主要作用機(jī)制是阻礙二氫葉酸的合成，從而抑制細(xì)菌的發(fā)育和繁殖，這在治療動(dòng)物疾病的應(yīng)用中具有重要意義[9]。目前，有關(guān)致病性大腸埃希菌分離株耐藥性研究表明其對(duì)卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素等具有較高的耐藥性等[10]，關(guān)于豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物耐藥性的檢測(cè)與分析尚鮮見(jiàn)。本試驗(yàn)主要探討豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌對(duì)于磺胺類藥物的耐藥性，以期為大腸埃希菌的耐藥性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為糞污的再次利用及糞污中細(xì)菌耐藥基因?qū)Νh(huán)境造成污染等方面的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本試驗(yàn)11株大腸埃希菌來(lái)源于四川省嘉陵江上游5個(gè)飼養(yǎng)管理規(guī)范的大型豬場(chǎng)的糞污樣品中，按照常規(guī)方法對(duì)大腸埃希菌進(jìn)行分離純化以及生化鑒定，然后進(jìn)行16 S rDNA驗(yàn)證，最后大腸埃希菌分離株在-20℃以200 mL/L的甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等均為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ 15E為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；MH培養(yǎng)基、藥敏紙片為廣州迪景公司產(chǎn)品；藥敏質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC25922為衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所生產(chǎn)；Mix、DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、瓊脂糖等為博瑞克生物公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Personal cycler PCR儀，Biometra公司產(chǎn)品；電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌耐藥基因型檢測(cè) 采用四川大學(xué)動(dòng)物疫病防控與食品安全四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制的“細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測(cè)試劑盒”對(duì)所分離的大腸埃希菌進(jìn)行磺胺類抗生素耐藥基因檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)磺胺類耐藥基因引物，引物序列見(jiàn)表1。由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。PCR 反應(yīng)體系為模板 DNA 0.8 μL，dd H2O 5.6 μL，2 ×TaqPCR Master Mix 7 μL，上、下游引物各 0.8 μL，共 15μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓，電泳 30 min，用凝膠成像儀觀察并拍照。

表1 磺胺類耐藥基因引物序列

1.2.2 大腸埃希菌耐藥表型檢測(cè) 對(duì)分離得到的大腸埃希菌在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的藥敏紙片擴(kuò)散法，用瓊脂稀釋法檢測(cè)大腸埃希菌分離株對(duì)于磺胺藥物的敏感性，測(cè)定對(duì)磺胺類藥物的最小抑菌濃度(MIC)，將大腸埃希菌ATCC25922做為質(zhì)控菌株。其判定結(jié)果根據(jù)NCCLS(2009)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)耐藥性以敏感和耐藥兩種形式進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

采用 multi-PCR 試劑盒對(duì)11株大腸埃希菌分離株進(jìn)行磺胺類藥物的耐藥基因檢測(cè)，11株大腸埃希菌中均檢測(cè)出的sul 1基因，有10株檢測(cè)出sul 2基因，sul 3基因在4 株大腸埃希菌中檢出。由此可知，sul 1基因檢出率為100%，sul 2基因檢出率為91%，sul 3基因檢出率為36%?；前奉惪股啬退幓騧ulti-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 大腸埃希菌耐藥性表型檢測(cè)結(jié)果

大腸埃希菌分離株進(jìn)行磺胺類藥物的耐藥表型

檢測(cè)結(jié)果表明，磺胺復(fù)合物(S3)、磺胺二甲基惡唑 (SF)、磺胺甲基惡唑 (RL)抑菌效果均較差，敏感率較低。表型檢測(cè)可知大腸埃希菌分離株對(duì)于磺胺類藥物的耐藥性較高(表2)。上述結(jié)果表明，分離的豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥性已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重。本試驗(yàn)所檢大腸埃希菌分離株磺胺類藥物的總檢出率為100%，有55%的菌株表現(xiàn)為多重耐藥。由此可知，磺胺類藥物不適合在本試驗(yàn)采集樣品的養(yǎng)殖場(chǎng)繼續(xù)使用。

3 討論

大腸埃希菌及其耐藥性研究具有重要的醫(yī)療臨床及公共衛(wèi)生意義，吸引了大量相關(guān)研究。植嬋萍等[12]報(bào)道的種鵝大腸埃希菌對(duì)于磺胺類藥物復(fù)方新諾明的耐藥率在90%以上。周瑩等[13]報(bào)道聊城地區(qū)雞源致病性大腸埃希菌對(duì)于磺胺類藥物磺胺甲噁唑的耐藥率在77.8%以上，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相類，表明大腸埃希菌對(duì)磺胺藥物普遍表現(xiàn)耐藥，在具體檢出率上存在差異。這種檢出率差異可能來(lái)自于不同養(yǎng)殖品種、不同的病原菌譜系、不同的用藥習(xí)慣、不同的藥物使用頻率等等，導(dǎo)致菌株在對(duì)磺胺耐藥性的產(chǎn)生、攜帶、傳遞及消減周期表現(xiàn)存在差異。但總體看來(lái)，大腸埃希菌對(duì)磺胺藥物的敏感率呈明顯下降趨勢(shì)，原因可能是由于抗菌藥物長(zhǎng)期、大量的不合理使用，也可能是因?yàn)榇竽c埃希菌對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，使大腸埃希菌對(duì)藥物的抗性增加。

1～11.大腸埃希菌菌株編號(hào)；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000

1-11.Codes ofE.coliisolates；M.DNA Maker DL 1 000

圖1 大腸埃希菌分離株中磺胺類藥物耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 Detective results of sulfonamide-resistant genes ofE.coliisolates

表2 大腸埃希菌耐藥表型檢測(cè)結(jié)果

注：“R”表示耐藥；“S”表示敏感。

Note："R"represents resistance;"S"represents sensitive.

磺胺類藥物具有抗菌譜廣，抑菌效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疾病的治療，但因其應(yīng)用較為普遍，細(xì)菌對(duì)其耐藥性也迅速增加。大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥機(jī)制，是由于攜帶耐藥基因的質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)一系列作用而在細(xì)菌之間以較高的頻率進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致了新二氫葉酸合成酶的出現(xiàn)，它具有可替代性及對(duì)磺胺類藥物親和力更低的特點(diǎn)。而編碼這類酶的sulR基因可以在細(xì)菌間通過(guò)整合子、轉(zhuǎn)座子以及質(zhì)粒等方式進(jìn)行傳遞，并且該基因可導(dǎo)致二氫葉酸合成酶表達(dá)水平提高，從而導(dǎo)致大腸埃希菌對(duì)磺胺類藥物的抗性增加[1]。sulR基因包括sul1、sul2、sul3這3種基因，其中sul2基因在豬源大腸埃希菌中分布是最廣泛的，在大腸埃希菌對(duì)磺胺藥物耐藥性方面的研究也具有重要意義[14]。本試驗(yàn)中，sul 1基因檢出率為100%、sul 2基因檢出率為90.9%、sul 3基因檢出率為36.4%，與以上研究結(jié)果相似；sul3基因的檢出率略低，究其原因可能是由于大腸埃希菌本身所擁有的該基因較少，也可能是由于基因的突變或質(zhì)粒的缺失而導(dǎo)致的。

大腸埃希菌在豬場(chǎng)生產(chǎn)線上普遍存在，磺胺藥物在規(guī)模豬場(chǎng)應(yīng)用面也較廣泛。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)豬場(chǎng)糞污中大腸埃希菌對(duì)磺胺藥物的耐藥性，及時(shí)了解大腸埃希菌對(duì)磺胺藥物耐藥狀況及其分子流行病學(xué)，探索其耐藥基因分布及傳播規(guī)律，并為大腸埃希菌的臨床防治、磺胺耐藥性研究以及尋找養(yǎng)殖糞污中耐藥研究的生物指示器提供科學(xué)依據(jù)。

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Detection of Drug Resistance Phenotypes and Genotypes of Sulfonamides inEscherichiacoliIsolated from Piggery Wastes

WEI Yong1，CHEN Mei-qi2,WANG Li2, DUAN Hui-qin2,XIAO Yun3,YU Ji-feng1,LI Xingyu1

(1.SichuanAnimalScienceAcademe,Chengdu,Sichuan,610064,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China; 3.AnimalHusbandryBureauofDazhuCounty,Dazhu, 635100,China)

In order to understand the drug resistance of sulfonamides inEscherichiacoliisolated from piggery wastewater, eleven isolates ofE.coliwere analyzed by K-B method according to the recommendation of the CLSI.Then, multi-PCR Kit method was used to detect sulfonamides-resistant genes(sul1,sul2,sul3).The result shows that resistant rates of elevenE.coliisolates to peptidylsulfanilamide, sulfamoxole and sulfamethoxazole were 45%，45% and 64% respectively.The detection rates of sul 1, sul 2 and sul 3 gene were 100%, 90.9% and 36.4%,respectively.The detection rate of all sulfonamide resistance genes was 100%.It will benefit the further study of drug-resistant mechanism ofE.coli.

E.coli；sulfonamide；drug resistance gene; piggery waste

2015-10-28

四川生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(sccxtd-004)； 四川省富民強(qiáng)縣項(xiàng)目(鄰水縣優(yōu)質(zhì)生豬健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)集成與產(chǎn)業(yè)化示范，2014)

魏 勇(1974-)，男，四川南充人，博士，副研究員，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.612;S859.795

A

1007-5038(2016)11-0057-04