林彥星，張彩虹，阮周曦，劉建利，宗 卉，廖立珊，孫 潔，楊俊興，呂建強(qiáng)，花群義，曹琛福

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳 518045)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)畜禽肉制品中鴨源性成分

林彥星，張彩虹，阮周曦，劉建利，宗 卉，廖立珊，孫 潔，楊俊興，呂建強(qiáng)，花群義，曹琛福*

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳 518045)

根據(jù)鴨mtDNA COX基因上的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測(cè)畜禽肉制品中的鴨源性成分。結(jié)果表明，建立的方法特異性強(qiáng)，與鵝、雞、羊、牛等15種動(dòng)物DNA無(wú)非特異性擴(kuò)增；靈敏度高，可檢測(cè)1.0 pg/μL鴨源DNA的存在；重復(fù)性好，同DNA濃度所測(cè)得Ct值的變異系數(shù)均小于3%；應(yīng)用該法對(duì)模擬混合樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與預(yù)期相符，且常見肉類DNA的存在并不影響該法對(duì)鴨源性成分檢測(cè)的靈敏度。說(shuō)明本試驗(yàn)建立的鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光定量PCR法特異、敏感、穩(wěn)定，可快速準(zhǔn)確檢測(cè)畜禽肉制品中含有的鴨源性成分。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；檢測(cè)；鴨源性成分

“民以食為天，食以安為先”，食品安全是關(guān)乎人人的重大民生問(wèn)題。肉制品中摻雜摻假是我國(guó)食品行業(yè)中存在的問(wèn)題之一，一些不法商販或企業(yè)為獲取高額利潤(rùn)，鋌而走險(xiǎn)以廉價(jià)的鴨肉冒充羊肉、牛肉進(jìn)行生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)，欺騙消費(fèi)者。由于鴨肉的紋理相對(duì)于豬肉比較像牛羊肉，且在加工過(guò)程中往往會(huì)加入羊肉粉、香精等添加劑以掩蓋其造假行為，使摻假產(chǎn)品具有更大的欺騙性和隱蔽性，這種肉類摻雜摻假行為違反我國(guó)《食品安全法》的有關(guān)要求，嚴(yán)重危害了公民的生命權(quán)和健康權(quán)，嚴(yán)重?cái)_亂了市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)秩序和社會(huì)秩序。因此，有必要建立敏感高效的方法來(lái)檢測(cè)肉畜禽肉制品中的鴨源性成分。

PCR是目前動(dòng)物源性成分鑒別的主流技術(shù)，因?yàn)椴煌锓N的基因組不同，依據(jù)物種的特異序列，可以用引物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增特異的產(chǎn)物來(lái)鑒別物種源性[1]。我國(guó)已經(jīng)建立了牛、羊、豬、馬、驢、兔、狗等動(dòng)物源性成分的普通PCR/實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)，但還未制定實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)鴨源性成分的標(biāo)準(zhǔn)。與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在封閉的體系中進(jìn)行擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)，無(wú)需電泳就可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的污染和EB(溴化乙錠)帶來(lái)的危害，自動(dòng)化程度高，檢測(cè)周期短，且擴(kuò)增目的片段較小，尤其適用于經(jīng)過(guò)深加工的食品，在動(dòng)物源性成分鑒別檢測(cè)中的具有廣闊的應(yīng)用前景[2-10]。

線粒體DNA( mitochondrial DNA,mtDNA) 是唯一存在于細(xì)胞器中且相對(duì)獨(dú)立的基因組[11]，具有高度的物種特異性，在細(xì)胞中的拷貝數(shù)多[12]，可有效降低食品加工造成的DNA損失[13]，是近年來(lái)動(dòng)物源性成分鑒定中用的較多的目標(biāo)基因。本項(xiàng)目通過(guò)比較分析鴨與其他畜禽類mtDNA中多個(gè)編碼區(qū)(coding sequence，CDS)的同源性，結(jié)合引物和探針的設(shè)計(jì)要求，最終選用細(xì)胞色素C氧化酶III(cytochrome c oxidase subunit III,COX3)作為靶基因；目前國(guó)內(nèi)外未見應(yīng)用熒光定量PCR擴(kuò)增該基因片段進(jìn)行鴨源性成分鑒定的報(bào)道。論文通過(guò)設(shè)計(jì)并篩選特異性引物和探針，對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以及特異性、靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn)等，建立了鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 高通量自動(dòng)化樣品處理工作站(FASTH21)，瑞士CONSUL AR公司產(chǎn)品；小型恒溫混勻儀、掌上離心機(jī)、臺(tái)式高速離心機(jī)(Centrifuge 5415 R)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；微量分光光度計(jì)Nanodrop 2000C，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀(7500 Fast Real-time PCR System)，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒(離心柱型)、深加工食品DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；Probe qPCR Mix，東洋紡(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品；引物與熒光探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物與TaqMan探針設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank已發(fā)表的鴨(Anas platyrhynchos)線粒體基因序列(NC-009684.1)，用Primer Express3.0及DNASTAR PrimerSelect軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增鴨COX3基因部分序列的特異性引物和探針。上游引物DP1序列為5′-CTTACTCACAACCTCAGGGCTAG-3′，下游引物DP2序列為5′-TGTAGGTGTGTGGTGGCCTT-3′，探針序列DQ為5′-(FAM) CTCATCTATCCTGCTAGCCGCCG(BHQ1)-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度151 bp。并將設(shè)計(jì)的引物探針序列與鵝、雞、鴿、鵪鶉、豬、牛、馬、羊等多種常見畜禽COX3上相對(duì)應(yīng)的基因片段進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 模板DNA的提取 稱取待檢樣品200 g，使用高通量自動(dòng)化樣品處理工作站對(duì)樣品進(jìn)行均質(zhì)處理。取50 mg樣品均質(zhì)于1.5 mL離心管中，加入600 μL～800 μL裂解液，65℃作用30 min，期間不時(shí)振蕩混勻；12 000 r/min離心5 min；轉(zhuǎn)移上清于潔凈離心管中，加入400 μL三氯甲烷-異丙醇(24∶1)，混勻；12 000 r/min離心5 min，取上清液；加0.8倍體積預(yù)冷的異丙醇，沉淀；12 000 r/min離心5 min，棄上清液；750 mL/L乙醇洗滌1次，晾干；加入50 μL滅菌雙蒸水溶解沉淀，制成DNA溶液，保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ部捎没蚪M提取試劑盒提取DNA。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系與條件 根據(jù)反應(yīng)體系母液的特性及其推薦的適用于7500 Fast熒光PCR儀的體系參數(shù)，設(shè)定反應(yīng)條件為95℃ 20 s；95℃ 3 s,60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)總體積為20 μL，其中Probe qPCR Mix 10 μL，50×ROX reference dye 0.04 μL，鴨肉模板DNA 0.8 μL，采用不同的引物濃度(5 pmol～20 pmol)和探針濃度DQ(2 pmol～10 pmol)配比，最后用雙蒸水補(bǔ)至20 μL，通過(guò)試驗(yàn)篩選出最佳的引物和探針濃度。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 分別用鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、綿羊、山羊、牛、豬、狗、魚等純?nèi)馓崛〉腄NA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證引物與探針對(duì)于鴨源性成分檢測(cè)的特異性；以鴨肉DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，并以雙蒸水為模板設(shè)置空白對(duì)照。另外，用普通PCR方法[14]對(duì)鴨肉DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 靈敏度試驗(yàn) 用微量分光光度計(jì)檢測(cè)鴨肉DNA濃度，然后以羊肉DNA做稀釋液，10×系列稀釋鴨肉DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，觀察該方法的靈敏度及羊肉成分的存在對(duì)靈敏度的影響，用羊肉DNA為模板作為陰性對(duì)照。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：將上述敏感性試驗(yàn)中100～10-4稀釋的共5個(gè)不同濃度DNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)；批間重復(fù)性試驗(yàn)：將5個(gè)不同濃度的DNA模板在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行3次獨(dú)立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)Ct值的差異計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)，評(píng)估所建立檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.7 模擬混合樣品中鴨源性成分的檢測(cè) 在牛肉、羊肉、豬肉、鵝肉中分別按50%、20%、10%、5%、1%的比例加入鴨肉，按1.2.2所述方法提取DNA，采用本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)20份模擬混合樣品進(jìn)行檢測(cè)，并分別設(shè)置牛肉、羊肉、豬肉、鵝肉4份陰性對(duì)照和1份空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 引物探針序列比對(duì)結(jié)果

利用DNAMan軟件將設(shè)計(jì)的引物探針序列與常見畜禽COX3基因片段進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)上游引物、下游引物以及探針與各對(duì)照物種間分別存在4個(gè)、3個(gè)和7個(gè)以上堿基的差異(表1)，差異值介于21.21%～39.39%，

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物、探針濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定20 μL反應(yīng)體系中，引物DP1、DP2各1 μL(10 pmol)，探針DQ 0.5 μL(5 pmol)。反應(yīng)條件為95℃ 20 s；95℃ 3 s,60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。熒光PCR結(jié)果鴨肉DNA出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

以鴨肉DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、綿羊、山羊、牛、豬、狗、魚肉等另外15種動(dòng)物DNA為檢測(cè)模板進(jìn)行引物探針的特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明，僅鴨的DNA擴(kuò)增出典型的S型曲線，其他物種模板及空白對(duì)照均無(wú)閾值信號(hào)產(chǎn)生(圖1)，表明該檢測(cè)方法特異性良好。而普通PCR(SN/T 3731.5-2013)也從所提取的鴨肉DNA中擴(kuò)增出約226 bp的DNA片段(圖2)，驗(yàn)證了該熒光PCR的特異性。

2.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

微量分光光度計(jì)測(cè)得鴨肉DNA濃度為37.1 ng/μL，以羊肉DNA為稀釋液做10×系列稀釋(100～10-6)，鴨肉DNA含量從37.1 ng/μL遞減到0.000 037 1 ng/μL；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示100～10-5稀釋的鴨肉DNA模板Ct值分別為17.534 9、21.496、25.120 4、28.420 1、31.602 6、35.672 1。其中，10-4稀釋對(duì)應(yīng)的鴨肉DNA濃度為3.71 pg/μL，擴(kuò)增曲線明顯，Ct值為31.602 6，說(shuō)明該方法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到pg級(jí)，且羊肉DNA的存在并不影響該方法對(duì)鴨源性成分檢測(cè)的靈敏度(圖3)。

表1 鴨源性成分檢測(cè)引物探針序列與其他物種相應(yīng)序列的比較

1.鴨肉DNA；2～16.分別是鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、綿羊、山羊、牛、豬、狗、魚DNA；17.空白對(duì)照

1.Duck DNA; 2-16.DNA of goose,chicken,turkey,pigeon,quail,francolin,ostrich,ass,horse,sheep,goat,cattle,pig,dog,fish respectively；17.Blank control

圖1 熒光PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

Fig.1 The results of specificity test by real-time PCR

由于10-5稀釋對(duì)應(yīng)的鴨肉DNA含量極微小(0.371 pg/μL)，Ct值為35.672 1，但未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；將鴨肉DNA含量稀釋至1 pg/μL時(shí)，Ct值小于35。綜合試驗(yàn)情況，將Ct值35作為該方法的檢測(cè)閾值，在實(shí)驗(yàn)判定有效的情況下，如有FAM熒光檢出，且Ct值≤35.0，則判定樣品中含有鴨源性成分；如未檢測(cè)到有Ct值或Ct值>35.0，則不含鴨源性成分或每微升含量低于pg級(jí)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.鴨DNA PCR產(chǎn)物；2.空白對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of duck DNA; 2.Blank control

圖2 普通PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 The results of PCR amplification

1～7.鴨肉DNA，DNA含量分別是37.1、3.71、0.371、0.037 1、0.003 71、0.000 371、0.000 037 1 ng/μL；8.陰性對(duì)照(羊DNA)；9.空白對(duì)照

1-7.Duck DNA contents were 37.1,3.71,0.371,0.037 1,0.003 71,0.000 371,0.000 037 1 ng/μL respectively；8.Negative control (sheep DNA); 9.Blank control

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)

Fig.3 Sensitivity test of real-time PCR

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

取100～10-4稀釋的共5個(gè)濃度的鴨肉DNA分別做3個(gè)批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)(圖4)和3個(gè)批間重復(fù)試驗(yàn)(圖5)。將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)0.62%～1.64%，批間變異系數(shù)(CV)0.24%～2.34%；而將批內(nèi)試驗(yàn)和批間試驗(yàn)加起來(lái)共6個(gè)重復(fù)中，同DNA濃度所測(cè)得Ct值變異系數(shù)(CV)0.86%～2.73%，均小于3%(表2)，說(shuō)明該方法具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1～3.鴨肉DNA 37.1 ng/μL；4～6.鴨肉DNA 3.71 ng/μL；7～9.鴨肉DNA 0.371 ng/μL；10～12.鴨肉DNA 0.037 1 ng/μL；13～15.鴨肉DNA 0.003 71 ng/μL；16.陰性對(duì)照(羊肉DNA)；17.空白對(duì)照

1-3.Duck DNA content were 37.1 ng/μL,4-6.Duck DNA 3.71 ng/μL,7-9.Duck DNA 0.371 ng/μL,10-12.Duck DNA 0.037 1 ng/μL,13-15.Duck DNA 0.003 71 ng/μL；16.Negative control (sheep DNA); 17.Blank control

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)

Fig.4 Reproducibility of intra-assay of real-time PCR

1～5.鴨肉DNA，含量分別是37.1、3.71、0.371、0.037 1、0.003 71 ng/μL；6.陰性對(duì)照(羊肉DNA)；7.空白對(duì)照

1-5.Duck DNA contents were 37.1,3.71,0.371,0.037 1,0.003 71 ng/μL respectively；6.Negative control (sheep DNA); 7.Blank control

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR批間重復(fù)試驗(yàn)

Fig.5 Reproducibility of inter-assay of real-time PCR

2.5 模擬混合樣品中鴨源性成分檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，在按50%、20%、10%、5%、1%的比例摻入鴨肉的牛肉、羊肉、豬肉、鵝肉中均獲得有效的擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確的檢出鴨源性成分，且隨著摻入量的減少，Ct值均相應(yīng)的升高；陰性對(duì)照及空白對(duì)照均未檢出，結(jié)果與預(yù)期完全相符。

表2 5份不同DNA濃度的鴨DNA模板的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)

3 討論

線粒體基因組分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)組織特異性，在所有組織細(xì)胞中，均含有大量的線粒體。通過(guò)檢索NCBI GenBank已發(fā)表的鴨、鵝、雞、火雞、鴿、鵪鶉、鷓鴣、鴕鳥、驢、馬、貓、綿羊、山羊、牛、狗、兔、豬細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ(COX3)基因序列，可知上述大部分動(dòng)物COX3基因大小為784 bp(火雞為787 bp，牛781 bp)，用軟件DNAMAN將鴨COX3基因片段分別與上述其他動(dòng)物進(jìn)行比較，在禽類間的一致性為80.56%～89.67%，與哺乳動(dòng)物類的一致性介于70.15%～74.74%之間。本試驗(yàn)根據(jù)鴨線粒體COX3基因設(shè)計(jì)多套用于擴(kuò)增其特異性片段的引物和探針，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度83 bp～165 bp，最終篩選出其中特異性最強(qiáng)一對(duì)引物探針，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為151 bp。目的片段較短，適于對(duì)畜禽肉制品中的鴨源性成分進(jìn)行檢測(cè)，這是因?yàn)槭称飞a(chǎn)加工過(guò)程中由于加工工藝等的不同，會(huì)受到加工工藝流程等方面的影響，肉類DNA片段會(huì)變小，因此利用PCR技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定時(shí)，目的片段要求盡可能較短[15]。

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR的研究中，判定是否陽(yáng)性的Ct值并沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，需根據(jù)不同的樣品、目的及引物探針的特異性來(lái)綜合分析并制定檢測(cè)閾值。本試驗(yàn)制定的方法將Ct值35作為該方法的陽(yáng)性判定值，鴨源性成分的檢測(cè)限介于10-4～10-5之間，即摻入的鴨肉DNA含量達(dá)1 pg/uL時(shí)就可以檢出。由于本試驗(yàn)制定的檢測(cè)鴨源性成分的實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度極高，畜禽肉制品中檢出含有鴨源性成分并不能簡(jiǎn)單判定摻假，還應(yīng)綜合分析，因?yàn)橐环矫鎿郊俚哪康氖谦@取更大的利潤(rùn)，摻入鴨肉的比例太低則無(wú)利可圖；另一方面正常的食品生產(chǎn)加工、運(yùn)輸中不同原料或產(chǎn)品間均存在著交叉污染的可能。本試驗(yàn)所建立的鴨源性成分實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速、簡(jiǎn)便，具有很好的特異性、靈敏度和重復(fù)性，為畜禽肉制品中鴨源性成分檢測(cè)提供了更為高效、便捷的檢測(cè)方法，適用于食品安全檢測(cè)、口岸出入境動(dòng)物產(chǎn)品的檢測(cè)等方面，應(yīng)用范圍廣泛，適用性強(qiáng)。

[1] 李麗娟，袁曉龍.源性成分鑒別檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36(5):107-110.

[2] 徐 瓊，張奕南，顧文佳，等.TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法定量檢測(cè)生肉中豬源性成分的建立[J].食品科技，2016，41(2):309-313.

[3] 張晶鑫，高玉時(shí)，樊艷鳳，等.利用PCR技術(shù)鑒別畜禽肉中鴨源性成分研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(34):202-203，322.

[4] 侯東軍，韓合敬，郝智慧，等.雙重?zé)晒釶CR法快速檢測(cè)飼料中牛羊源成分[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(2):247-250.

[5] 趙 新，王 永，蘭青闊，等.熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分[J].食品工業(yè)科技，2015，36(1):299-302，308.

[6] 陳 軒，廖秀云，陶 旻，等.Taqman探針熒光PCR檢測(cè)鯊魚源性成分[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2015,34 (10):1083-1088.

[7] 范麗麗，李 培，傅春玲，等.食品中雞源性成分實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J].食品科學(xué)，2014，35(2):248-251.

[8] 王 瑋，呂青骎，朱盧璽，等.食品中馬源性成分的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，34(9):961-964.

[9] 熊 蕊，郭鳳柳，劉曉慧，等.肉制品中犬源性成分PCR檢測(cè)方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(8):9-12.

[10] 岳 苑.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)清真食品中馬、驢源性成分[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(22):5518-5522.

[11] 張素素，孫 嘉.線粒體DNA拷貝數(shù)的研究新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2014，20(24):4417-4419.

[12] Yoshinobu K.Antioxidative roles of sezamin，a functional lignan in sesame seed and it’s effect on lipid and alcohol -metabolism in the liver：a DNA microarray study[J].Bio Factors,2004，(21):191-196.

[13] Zhang J，Huang H，Cai Z,et al.Species identification in salted products of red snappers by semi-nested PCR-RFLP based on the mitochondrial 12S rRNA gene sequence[J].Food Control,2006,17(7):557-563.

[14] SN/T 3731.5-2013 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法(第5部分):鴨成分檢測(cè)PCR法[S].

[15] Martín I，García T，F(xiàn)ajardo V,et al.SYBR-Green real-time PCR approach for the detection and quantification of pig DNA in feedstuffs[J].Meat Sci,2009,82(2):252-259.

A Real-time Fluorescent PCR for Detection of Duck-derived Ingredients in Meat Products of Livestock and Poultry

LIN Yan-xing,ZHANG Cai-hong,RUAN Zhou-xi,LIU Jian-li,ZONG Hui,LIAO Li-shan, SUN Jie,YANG Jun-xing,LV Jian-qiang,HUA Qun-yi,CAO Chen-fu

(ShenzhenEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Shenzhen，Guangdong,518045,China)

To develop a real-time fluorescent PCR assay for detection of duck-derived ingredients in meat products of livestock and poultry,the specific PCR primers andTaqman probe were designed based on the conserved sequence of cytochrome c oxidase subunit III gene of duck mitochondrial DNA.The results show that,the assay had high specificity and sensitivity,only amplifies the target gene fragment of duck and the detection limit is 1.0 pg/μL.And this assay had good reproducibility,the coefficient of variation of Ct values is less than 3%.Application of the assay to detect simulation mixed samples,the result is in line with expectations,and the presence of common meat DNA did not affect the sensitivity of detection of duck-derived ingredients.In summary,this real-time fluorescent PCR assay is specific,sensitive and stable,It can quickly and accurately detect the duck-derived ingredients in meat.

real-time fluorescent PCR; detection; duck-derived ingredients

2016-04-18

林彥星(1980-)，男，廣東潮州人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫工作。*通訊作者

S851.4

A

1007-5038(2016)11-0048-06