李曉光　郭小龍　郭斌中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院口腔科，北京 100853

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BMAL1基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用

李曉光郭小龍郭斌
中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院口腔科，北京 100853

[摘要]牙周炎是以牙周組織破壞為特征的感染性疾病，作為重要的牙周組織再生種子細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在重構(gòu)牙周組織結(jié)構(gòu)和功能、促進(jìn)牙周病好轉(zhuǎn)乃至愈合方面具有重要作用，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的特性尤其是其成骨分化的相關(guān)調(diào)控機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)之一。BMAL1基因與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化等諸多生理行為的調(diào)控關(guān)系密切，有望成為牙周疾病新的治療靶點(diǎn)。本文對(duì)BMAL1基因的特性以及調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制作一綜述。

[關(guān)鍵詞]BMAL1基因；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；牙周炎

Supported by: The National Natural Science Foundation of China (81470754).Correspondence: Guo Bin, E-mail: guobin0408 @126.com.

慢性牙周炎已成為最常見(jiàn)的口腔慢性疾病之一，牙周袋形成和牙槽骨吸收是慢性牙周炎的主要臨床特征。牙槽骨的慢性喪失與機(jī)體成骨能力的退化密切相關(guān)，主要來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨向分化的成骨細(xì)胞是骨形成的重要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，增齡、炎癥等因素均可影響B(tài)MSCs的分化和增殖能力，使成骨細(xì)胞生成數(shù)量下降，最終導(dǎo)致骨形成顯著減少[1-2]，這也是糖尿病加速牙周炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。BMAL1基因是近日節(jié)律基因的重要成員，BMAL1基因的活性與諸多基因表達(dá)和血糖代謝等生物行為活動(dòng)的節(jié)律性密切相關(guān)，更與BMSCs的成骨分化直接相關(guān)[3]，但是其調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，探究BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上逆向調(diào)控，促進(jìn)BMSCs成骨分化，防止骨組織的退行性改變，促進(jìn)慢性牙周炎的好轉(zhuǎn)乃至愈合成為研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)BMAL1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過(guò)程中可能發(fā)揮的調(diào)控作用及機(jī)制作一綜述。

1　BMSCs是牙周組織再生、促進(jìn)慢性牙周炎愈合的基礎(chǔ)

慢性牙周炎是以菌斑為始動(dòng)因子，牙齦、牙槽骨、牙周膜等牙周組織破壞為特征的慢性炎癥性疾病。盡管包括牙周基礎(chǔ)治療在內(nèi)的牙周序列治療可以有效地控制菌斑、消除炎癥，但是只能延緩牙周組織的吸收破壞，難以修復(fù)已缺損的組織；而目前較流行的引導(dǎo)組織再生術(shù)，只能部分再生牙周組織，不能實(shí)現(xiàn)牙周組織的生理和功能性再生[4]。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)為牙周組織再生和牙周疾病的治療提供了新的研究思路，其核心要素是具有多向分化潛能的種子細(xì)胞。相較于牙周膜干細(xì)胞等牙源性干細(xì)胞，BMSCs在牙周組織再生治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。研究[5]發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，可減少炎性因子的產(chǎn)生和定向遷移，還可直接或間接發(fā)揮抗菌和保護(hù)組織的功能，最近還有研究[6]證實(shí)，炎性狀態(tài)下BMSCs較牙周膜干細(xì)胞具有更強(qiáng)的成骨分化能力。因此，BMSCs是牙周組織再生技術(shù)中主要的干細(xì)胞來(lái)源，探索BMSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制，提高其成骨效率，促進(jìn)牙槽骨結(jié)構(gòu)和功能重建已成為研究的熱點(diǎn)。

2　BMAL1基因是機(jī)體生理活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子

生物鐘存在于機(jī)體大部分組織和細(xì)胞內(nèi)，是調(diào)節(jié)體內(nèi)能量平衡和代謝等生理活動(dòng)的重要因素[7]。節(jié)律基因主要包括BMAL1基因、生物鐘循環(huán)輸出蛋白（circadian locomoter output cycle kaput，CLOCK）、周期基因家族（Period，Per，包括Per1、Per2和Per3）、隱花色素家族（Cryptochrome，Cry，包括Cry1和Cry2）、神經(jīng)PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2等，其中BMAL1基因是機(jī)體生物鐘的核心組件，在視交叉上核和外周組織如長(zhǎng)骨、造血干細(xì)胞乃至整個(gè)骨髓中均有表達(dá)，其常與CLOCK基因形成二聚復(fù)合體后結(jié)合到Per 或Cry基因的啟動(dòng)子上對(duì)其轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，而Per或Cry轉(zhuǎn)錄翻譯后又反饋抑制BMAL1/CLOCK二聚體的形成，從而起到調(diào)控生物近日節(jié)律的作用[8]。BMAL1基因的節(jié)律性表達(dá)可以使執(zhí)行其功能的BMAL1蛋白周期性表達(dá)[9]，因此受其影響的下游基因也產(chǎn)生節(jié)律性表達(dá)，從而對(duì)體內(nèi)的一系列生理生化反應(yīng)產(chǎn)生影響。

機(jī)體節(jié)律的紊亂，特別是BMAL1基因表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致腫瘤和代謝綜合征的發(fā)生[10-11]。例如BMAL1基因與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。BMAL1基因參與調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的節(jié)律性分泌[12]，BMAL1基因缺失可以導(dǎo)致小鼠的晝夜節(jié)律完全喪失，體內(nèi)血糖水平的節(jié)律性振蕩發(fā)生紊亂甚至消失[13]，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生或惡化。BMAL1基因突變會(huì)使小鼠胰島中與細(xì)胞生長(zhǎng)、突觸囊泡裝配相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，從而使小鼠表現(xiàn)出糖耐量受損、胰島素分泌減少以及胰島細(xì)胞形態(tài)和增殖異常等改變，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，癥狀逐漸惡化[14]。近年來(lái)研究[15]證實(shí)，BMAL1-/-小鼠中BMAL1基因的靶基因抗氧化調(diào)節(jié)因子-核因子NF-E2相關(guān)因子（nuclear factorerythroid 2-related factor，Nrf2）表達(dá)減弱，胰島β細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）和順向線粒體解偶聯(lián)大量積累，細(xì)胞內(nèi)氧化平衡被打破，胰島素分泌減少。也有研究[16]認(rèn)為，BMAL1-/-鼠中線粒體脫偶聯(lián)蛋白2（uncoupling proteins，UCP2）增加，導(dǎo)致β細(xì)胞線粒體破壞，胰島素分泌動(dòng)力不足，從而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。眾所周知，糖尿病是慢性牙周炎的全身促進(jìn)因素，糖尿病性牙周炎患者牙槽骨吸收速度快、病情嚴(yán)重，這可能與糖尿病環(huán)境下BMSCs的成骨分化能力受到明顯抑制有關(guān)。研究[17]顯示，糖尿病大鼠BMSCs的增殖和成骨分化能力明顯下降。Kim等[18]將患有妊娠期糖尿病的孕婦與健康孕婦比較，發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病患者臍周血BMSCs的活性和成骨分化能力受到明顯抑制。這一現(xiàn)象與多種通路和因子有關(guān)，例如可能與受損的胰島素和胰島素生長(zhǎng)因子1通路抑制BMSCs的增殖和成骨分化有關(guān)[19]，也可能是因?yàn)樘悄虿…h(huán)境下細(xì)胞內(nèi)ROS的大量堆積激活PI3K/Akt通路抑制BMSCs成骨分化[20]，并且糖尿病患者經(jīng)胰島素治療后可部分恢復(fù)BMSCs的成骨分化能力[21]。因此，BMAL1基因是血糖代謝調(diào)控和BMSCs成骨分化調(diào)控的結(jié)合點(diǎn)，而在糖尿病環(huán)境下BMAL1基因?qū)MSCs的增殖和成骨分化的調(diào)控機(jī)制尚沒(méi)有明確結(jié)論，成為當(dāng)前糖尿病性牙周炎研究的熱點(diǎn)。

3　BMAL1基因是調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的重要因子

BMAL1基因在BMSCs成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。相較于野生型小鼠，BMAL1-/-小鼠過(guò)早表現(xiàn)出諸如BMSCs成骨能力下降、牙槽骨缺損等早熟現(xiàn)象，而提高BMAL1-/-小鼠中BMAL1基因的表達(dá)水平后，BMSCs的增殖和分化能力會(huì)得到一定程度的修復(fù)[22]。BMAL1基因可能通過(guò)兩種方式影響骨的形成，一種方式是影響可分化為成骨細(xì)胞的BMSCs的增殖[23]，另一種方式是直接作用于骨形成的某個(gè)階段。隨著B(niǎo)MSCs老化，其增殖分化能力和細(xì)胞中BMAL1基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)出高度一致的下降趨勢(shì)，BMSCs增殖和成骨分化能力的下降，最終會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)流失[24-25]；而人為抑制BMAL1基因正向調(diào)節(jié)因子視黃酸相關(guān)孤兒受體（retinoid-related orphan receptors，RORs）的活性，會(huì)導(dǎo)致牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白和骨涎蛋白代謝的下降[26]。

綜上，BMAL1基因作用廣泛，常與同家族的CLOCK基因形成復(fù)合體發(fā)揮作用，與多種細(xì)胞因子的代謝密切相關(guān)，并可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)BMSCs的成骨分化。

4　BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化的可能機(jī)制

4.1通過(guò)Wnt信號(hào)通路影響B(tài)MSCs成骨分化

Wnt通路是調(diào)控干細(xì)胞增殖和多向分化的關(guān)鍵途徑，是目前已知的和BMSCs骨向分化關(guān)系最密切的信號(hào)通路之一。Wnt信號(hào)通路以是否有β連環(huán)蛋白（β-catenin）參與而分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典信號(hào)通路。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典信號(hào)通路均在BMSCs骨向分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且兩者之間還相互影響，例如Wnt3a對(duì)BMSCs增殖有促進(jìn)作用，而Wnt5a可通過(guò)非經(jīng)典途徑拮抗Wnt3a的作用[27]。經(jīng)典Wnt通路在BMSCs成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，可通過(guò)上調(diào)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osterix等促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，還可以通過(guò)減少脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)抑制BMSCs的脂向分化[28]。針對(duì)非經(jīng)典信號(hào)通路的研究還較少，研究發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典信號(hào)通路配體Wnt5可下調(diào)成脂標(biāo)志物過(guò)氧化物酶體增殖受體的表達(dá)，從而促進(jìn)干細(xì)胞由成脂向成骨分化轉(zhuǎn)變[29]。

BMAL1基因已被發(fā)現(xiàn)與Wnt信號(hào)通路的功能以及其成員的表達(dá)和代謝密切相關(guān)。在BMSCs成骨分化過(guò)程中，特別是在成骨誘導(dǎo)7 d后，BMAL1基因與Wnt信號(hào)通路發(fā)揮高度一致的協(xié)同作用[30]。目前針對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的核心因子β-catenin與BMAL1基因的研究較多，但仍處于現(xiàn)象描述階段，在BMSCs成骨分化過(guò)程中BMAL1基因調(diào)控β-catenin的可能機(jī)制還有待深入研究。Zhang等[31]證實(shí)，β-catenin的表達(dá)隨著年齡增長(zhǎng)逐漸下降，與BMAL1基因的變化規(guī)律相近。在BMAL1基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，β-catenin的表達(dá)明顯增強(qiáng)[32]，但是其機(jī)制尚未明確，可能與減少β-catenin的降解有關(guān)[33-35]。關(guān)于BMAL1基因?qū)Ζ耤atenin轉(zhuǎn)錄促進(jìn)作用的研究很少，這是因?yàn)榭赡苓€有其他因素參與了BMAL1基因?qū)Ζ?catenin的表達(dá)調(diào)控[32]，例如RORs在BMAL1基因促進(jìn)β-catenin轉(zhuǎn)錄過(guò)程中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[26]。因此盡管已有研究[27]證明，β-catenin是BMAL1基因的靶基因，二者通過(guò)啟動(dòng)子上的一段順式作用元件E-box結(jié)合而發(fā)揮作用，但在BMSC成骨分化過(guò)程中厘清二者相互作用的具體機(jī)制是研究的難點(diǎn)。針對(duì)BMAL1基因與Wnt通路其他成員（配體和受體）關(guān)系的研究還較少，Janich等[36]研究發(fā)現(xiàn)，BMAL1-/-鼠中包括Lef1 和Wnt10a在內(nèi)的多種Wnt相關(guān)基因的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但是具體機(jī)制尚不明確，因此BMAL1基因如何調(diào)控Wnt配體或受體的表達(dá)需要進(jìn)一步的研究。

4.2影響Runx2表達(dá)調(diào)控BMSCs成骨分化

Runx2是已知的骨形成過(guò)程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子之一，具有引導(dǎo)BMSCs骨向分化、抑制其成軟骨和成脂向分化的作用。Runx2敲除鼠可表現(xiàn)出明顯的成骨分化異常，反之Runx2的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)BMSCs的成骨分化。Runx2以及若干下游靶基因在骨組織中呈現(xiàn)出具有晝夜節(jié)律性的表達(dá)特點(diǎn)，并且在骨生成以及BMSCs成骨分化過(guò)程中Runx2和以BMAL1基因?yàn)榇淼墓?jié)律基因之間具有密切的相互關(guān)系[37]。盡管有研究證實(shí)Runx2啟動(dòng)子上有一固定片段5-CACATG-3’是Myc家族的結(jié)合位點(diǎn)，且與BMAL1基因結(jié)合位點(diǎn)E-box片段（5’-CACGTG-3’）相近，但BMAL1基因是否通過(guò)該片段調(diào)控RUNX2的表達(dá)需要進(jìn)一步的研究[38]。BMAL1基因除了直接調(diào)控Runx2的表達(dá)，還可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β，TGF-β）等多種因子和通路間接調(diào)控Runx2的表達(dá)[39]。BMAL1基因與Runx2之間的關(guān)系還有待更深入的研究。

4.3通過(guò)p53/p21信號(hào)通路途徑調(diào)控BMSCs成骨分化

牙槽骨增齡性萎縮與BMSCs凋亡和成骨分化能力的下降密切相關(guān)。BMSCs衰老和凋亡受到p53/p21信號(hào)通路的調(diào)控，并且該通路核心因子p53可以通過(guò)激活microRNA-34抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄，從而影響B(tài)MSCs的成骨分化[40]。p53的表達(dá)受到BMAL1基因的調(diào)控，BMAL1基因表達(dá)降低會(huì)使中樞生物鐘-交感神經(jīng)-外周組織生物鐘軸失調(diào)[41]，而后者起到抑制p53表達(dá)的作用，由此可見(jiàn)BMAL1基因可通過(guò)影響p53的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控作用。

BMAL1基因還深度介入炎癥免疫的調(diào)控，與單核細(xì)胞[42]、TGF-β[43]等多種炎癥細(xì)胞和因子的增殖、表達(dá)密切相關(guān)，推測(cè)BMAL1基因可以通過(guò)對(duì)后者的調(diào)控間接實(shí)現(xiàn)對(duì)BMSCs成骨分化的影響。

目前對(duì)于BMAL1基因如何調(diào)控BMSCs成骨分化的研究較少，這可能是因?yàn)椋?）BMAL1基因與多種生理或病理現(xiàn)象相關(guān)，并且參與多種信號(hào)通路，與若干因子形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的直接或間接影響B(tài)MSCs成骨分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此厘清BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化的機(jī)制尚有一定的難度；2）BMAL1基因常與同家族的CLOCK基因形成二聚體后才發(fā)揮相應(yīng)效應(yīng)，這也在一定程度上阻礙了對(duì)BMAL1基因功能的認(rèn)識(shí)。

以BMSCs為主要細(xì)胞來(lái)源的牙周組織再生技術(shù)在促進(jìn)牙槽骨再生、加速牙周疾病的好轉(zhuǎn)乃至愈合等方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用[44]，為重建牙周組織正常結(jié)構(gòu)創(chuàng)造了可能。BMAL1基因可能參與炎癥免疫、血糖代謝和BMSCs成骨分化的調(diào)控，通過(guò)對(duì)BMAL1基因調(diào)控BMSCs成骨分化相關(guān)機(jī)制的研究，將為尋找牙周疾病治療的新靶點(diǎn)、重建牙周組織的形態(tài)和功能提供新的途徑。

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（本文編輯 李彩）

BMAL1 gene regulates the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells

Li Xiaoguang, Guo Xiaolong, Guo Bin.(Dept.of Stomatology, The PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[Key words]BMAL1 gene;bone marrow mesenchymal stem cells;osteogenic differentiation;periodontitis

[Abstract]Periodontitis is a chronic infective disease characterized as the destruction of the supporting tissues of the teeth.Bone marrow mesenchymal stem cells, which are ideal adult stem cells for the regeneration of supporting tissues, may play important roles in restoring the structure and function of the periodontium and in promoting the treatment of periodontal disease.As a consequence, the characteristics, especially osteogenic differentiation mechanism, of these stem cells have been extensively investigated.The regulation of the physiological behavior of these stem cells is associated with BMAL1 gene.This gene is a potential treatment target for periodontal disease, although the specific mechanism remains inconclusive.This study aimed to describe the characteristics of BMAL1 gene and its ability to regulate the osteogenic differentiation of stem cells.

[中圖分類號(hào)]Q 78

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.019

[收稿日期]2015-11-16； [修回日期]2016-02-18

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（81470754）

[作者簡(jiǎn)介]李曉光，博士，E-mail：xiaopa3084@126.com

[通信作者]郭斌，教授，博士，E-mail：guobin0408@126.com