劉長鐵　劉兵兵　晏小榮

摘要：目的 探討脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法。方法 ①選擇新西蘭大耳白兔24 只，雙下肢髁關(guān)節(jié)面上共制作3個直徑 3 mm、深3 mm 的全層軟骨缺損， 自左到右為：空白對照組（A組）， 脫鈣骨基質(zhì)（B組），脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（C組）；②分別于術(shù)后 4，8，12 w各處死8只，應(yīng)用大體觀察、組織學(xué)觀察及組織學(xué)評分評估缺損軟骨的修復(fù)情況。結(jié)果 脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組術(shù)后 12 w、組織切片顯示新生組織中可見大量類透明軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，修復(fù)組織和周圍軟骨整合良好。C組各個時間點(diǎn)組織學(xué)評分均高于其他兩組（P<0.05）。結(jié)論 脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提高了對兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)效果。

關(guān)鍵詞：脫鈣骨基質(zhì)；關(guān)節(jié)軟骨；自體；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

組織工程學(xué)的發(fā)展給關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)帶來了生物學(xué)治療的美好前景。本實(shí)驗(yàn)在前期成功將自體間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離的基礎(chǔ)上，將之與可降解生物材料脫鈣骨基質(zhì)在體外短暫復(fù)合， 然后移植修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損，以探討一種實(shí)用的關(guān)節(jié)軟骨缺損組織工程修復(fù)方法。

1 資料與方法

1.1脫鈣骨基質(zhì)材料的制備 將新西蘭大耳白兔處死后，取其骼骨，剔除骨膜、軟骨及軟組織，反復(fù)沖洗清除骨髓、血污及表面油脂，制備成4.0mm×4.0mm×3.0mm的條塊狀。

1.2方法 同一兔中雙下肢髁關(guān)節(jié)面上共制作3個直徑3mm、深3 mm的全層軟骨缺損，自左到右為：自左到右為：空白對照組（A組），脫鈣骨基質(zhì)（B組），脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（C組）。查隨機(jī)數(shù)字表將24只大白兔隨機(jī)分為4、8 w和12 w三組。

1.3動物模型制做 做動物模型主要分為以下幾點(diǎn)：①術(shù)區(qū)備皮，手術(shù)者將兔取仰臥位，進(jìn)行雙下肢備皮，常規(guī)消毒鋪巾。用3 mm的鉆頭在右股骨內(nèi)外髁左股骨內(nèi)髁造出直徑0.3cm、深度為0.3 cm全層厚軟骨缺損模型；②材料植入，徹底止血，用生理鹽水沖洗創(chuàng)口；③動物在相同條件下飼養(yǎng)。

1.4觀察指標(biāo) ①動物術(shù)后的具體情況；②關(guān)節(jié)面的修復(fù)情況；③缺損區(qū)新生組織組織學(xué)觀察及組織學(xué)評分（Wakitani評分）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組織學(xué)評分?jǐn)?shù)據(jù)均記作（x±s），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差單向方差分析用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理， 比較各組評分與正常值均數(shù)間的差異，α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1大體觀察 C組：術(shù)后12 w修復(fù)區(qū)表面平整光滑，與周圍正常軟骨難以區(qū)分，色澤為瓷白色。B組：術(shù)后12 w外觀略有凹陷，色澤與周圍組織接近但仍可區(qū)分。A組：術(shù)后12 w缺損仍明顯，可見肉芽組織部分充填缺損。

2.2組織學(xué)觀察 C組：12 w后細(xì)胞體積較大數(shù)量較多，可見柱狀排列，與周圍正常軟骨組織相近，修復(fù)組織和周圍軟骨整合良好，TB染色為陽性。B組：12 w后HE染色可見短小卷曲的膠原纖維和軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞排列不規(guī)則，TB染色為弱陽性。C組：12 w后缺損仍存在，缺損底部可見纖維組織充填部分缺損，TB染色為陰性。

2.3組織學(xué)評分 見表1。

表1結(jié)果表明， A組4、8、12 w評分值與C組相應(yīng)時刻評分值比較差異顯著（P<0.01）；A組4、8、12 w評分值與B組相應(yīng)時刻評分值比較差異顯著（P<0.01）；B組4、12w評分值與C組相應(yīng)時刻評分值比較差異顯著（P<0.01）。

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種嚴(yán)重危害中老年人健康的退行性疾病，隨著老齡社會的到來，OA的發(fā)病率以驚人的速度逐年增長，據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，在50歲以上的人口中，其發(fā)病率僅次于心臟病而居第2位，給越來越多的患者帶來了肉體乃至精神上的痛苦和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)，其病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞、軟骨下硬化，關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生、骨贅形成。所以，關(guān)節(jié)軟骨治療是OA治療的關(guān)鍵，關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏血管分布，當(dāng)缺損直徑超過3 mm時，不但自身再生修復(fù)能力有限，還可繼發(fā)周圍軟骨的退變，最終出現(xiàn)嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)功能明顯受限。目前臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法很多，但沒有公認(rèn)最優(yōu)的能實(shí)現(xiàn)長期透明軟骨修復(fù)的方法，組織工程技術(shù)是再生修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損最具有潛力的方法之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是骨髓中來源于中胚層、具有很強(qiáng)的增殖能力和多向分化特性的未分化的干細(xì)胞[1]。在不同誘導(dǎo)環(huán)境下，它可分化成為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等， 并且這些細(xì)胞之間具有相互轉(zhuǎn)化的能力[2]，vanosch、zhou、Cao等[5]發(fā)現(xiàn)鈣骨基質(zhì)具有成軟骨能力，可以誘導(dǎo)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。

本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離與脫鈣骨基質(zhì)短暫復(fù)合后移植入缺損關(guān)節(jié)處提高其修復(fù)效果，獲得了較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。初步觀察結(jié)果顯示，術(shù)后第4 w，脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合自體間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合物植入缺損，修復(fù)面較平整；到第8 w時修復(fù)組織與周圍組織融合良好，修復(fù)表面平整；術(shù)后第12 w修復(fù)面平整光潔。

本實(shí)驗(yàn)探討了用利用密度梯度離心原理對骨髓血進(jìn)行快速細(xì)胞分離提取MSCS作為種子細(xì)胞復(fù)合脫鈣骨基質(zhì)支架材料移植用于修復(fù)實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)方法，在國內(nèi)外報(bào)道不多，并取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果，為臨床關(guān)節(jié)軟骨損傷的生物學(xué)治療提供了一個新的思路。

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