楊 雪，王 軍；劉紅羽；呂文發(fā)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物繁殖生物技術(shù)研究室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物繁殖生物技術(shù)研究室，吉林長(zhǎng)春 130118)

TDGF1基因研究概況

楊 雪1，王 軍2；劉紅羽2；呂文發(fā)2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動(dòng)物繁殖生物技術(shù)研究室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物繁殖生物技術(shù)研究室，吉林長(zhǎng)春 130118)

畸胎瘤衍化生長(zhǎng)因子(teratocarcinoma-derived growth factor1，TDGF1)是一種調(diào)控細(xì)胞存活、增殖、分化和遷移的小分子糖基磷脂酰肌醇(GPI)結(jié)合蛋白。TDGF1在正常組織中一般不表達(dá)或僅部分組織少量表達(dá)，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)極顯著。以往有關(guān)TDGF1的報(bào)道多集中于腫瘤和早期胚胎發(fā)育，研究發(fā)現(xiàn)，TDGF1通過(guò)調(diào)控肌肉生成抑制素(myostatin, MSTN)信號(hào)參與成肌細(xì)胞的增殖分化。在肌源性細(xì)胞中，TDGF1的表達(dá)是CFC(Cripto-1/FRL-1/Crypic)區(qū)與ALK4(anaplastic lymphoma kinase 4)結(jié)合從而轉(zhuǎn)化MSTN信號(hào)。下調(diào)TDGF1，MSTN的信號(hào)隨之減弱，表明TDGF1對(duì)肌源性細(xì)胞中MSTN調(diào)控的重要性，并且EGF和CFC區(qū)對(duì)MSTN的調(diào)控都很重要。論文綜述了TDGF1的分子基礎(chǔ)研究及其對(duì)成肌細(xì)胞增殖分化的作用。

畸胎瘤衍化生長(zhǎng)因子；信號(hào)通路；肌肉生成抑制素；成肌細(xì)胞

TDGF1由Alfredo等1987 年發(fā)現(xiàn)，是從未分化的人畸胎瘤細(xì)胞 NTERA2 細(xì)胞系 cDNA文庫(kù)中釣取并鑒定的基因[1]。編碼TDGF1的基因定位于常染色體 3p21.3，基因全長(zhǎng) 2 kb或1.7 kb，分別包含6個(gè)外顯子、5個(gè)內(nèi)含子，4個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，開(kāi)放閱讀框564 bp。編碼的蛋白位于EGF-CFC(epidermis growth factor-cripto-1 / FRL-1 / crypic)區(qū)，由 188 個(gè)氨基酸組成，其中EGF結(jié)構(gòu)域和 CFC結(jié)構(gòu)域是 TDGF1蛋白內(nèi)部具有標(biāo)志性的功能結(jié)構(gòu)域[2]。所有的EGF-CFC蛋白在EGF區(qū)都含有一個(gè)O-糖苷鍵型巖藻糖基化位點(diǎn)，是作為T(mén)GF-β、Nodal和GDF1的共同受體所必需的位點(diǎn)。大多數(shù)動(dòng)物的EGF-CFC蛋白是細(xì)胞相關(guān)糖蛋白，包含第171～202氨基酸，片段大小為18 ku～21 ku。然而小鼠和人類(lèi)的TDGF1蛋白分別是24、28、36 ku，原因是形成了N-糖苷鍵絲氨酸殘基和O-糖苷鍵天冬氨酸殘基。TDGF1全部生物活性的表達(dá)需要完整的EGF和CFC區(qū)，所有的EGF-CFC蛋白都包含1個(gè)信號(hào)序列、1個(gè)特異性EGF類(lèi)似區(qū)、1個(gè)絲氨酸富含區(qū)是CFC區(qū)、1個(gè)疏水的碳末端。盡管所有的家族成員在EGF和CFC區(qū)都表現(xiàn)出高度同源性，小鼠和人的EGF-CFC區(qū)的序列相似性高達(dá)94%，但是整個(gè)序列的同源性僅達(dá)到22%～32%，這表明N末端和C末端無(wú)生物學(xué)功能，只是減少序列的相似性。TDGF-1 蛋白的C-端包括一個(gè)磷脂酰肌醇(GPI)錨定位點(diǎn)，是TDGF1蛋白的細(xì)胞膜結(jié)合位點(diǎn)[3]。

1 TDGF1 調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑

1.1 Nodal/ALK4/ALK7/Smad2信號(hào)通路

在胚胎發(fā)育期間，EGF-CFC蛋白作為細(xì)胞表面Nodal 共同受體,活化絲/蘇氨酸激酶(ALK4)和Ⅱ型受體(ActRⅡB)復(fù)合物，此生化機(jī)制對(duì)Nodal結(jié)合ALK4/ActRⅡB受體復(fù)合物并且刺激Smad2磷酸化是必不可少的[4]。TDGF1也可以直接和絲/蘇氨酸激酶受體ALK7相互作用增強(qiáng)ALK7結(jié)合Nodal的能力。盡管TDGF1可增強(qiáng)ALK7的信號(hào)活性，但Nodal是在TDGF1缺失時(shí)直接結(jié)合ALK7。Nodal與ALK4 的結(jié)合是TDGF1 依賴性的；而與ALK7的結(jié)合是TDGF1 非依賴性，定點(diǎn)誘變?cè)囼?yàn)表明TDGF1與Nodal相互作用在EGF區(qū)，而TDGF1結(jié)合ALK4是在CFC區(qū)。Nodal信號(hào)在胚胎發(fā)育初期對(duì)TDGF1調(diào)控胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化是必不可少的[5]。

1.2 Activin/ALK4/ALK7/Smad2信號(hào)通路

研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，膜錨定型TDGF1 的CFC結(jié)構(gòu)域可以與Activin相互作用，但是這種結(jié)合作用依賴于ActRⅡ的存在，形成一個(gè)由Activin- ActRⅡ-TDGF1 三者構(gòu)成的復(fù)合物,激活素受體活化機(jī)制是通過(guò)與Ⅱ型受體(ActRⅡ)結(jié)合并磷酸化，之后活化Ι型受體(ALK4)，激活素受體機(jī)制是高度繁瑣復(fù)雜的，除激活素外，還可與Nodal、GDF1、GDF3、MSTN形成信號(hào)復(fù)合物[6]。激活的Ⅰ型受體繼而活化絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，磷酸化底物Smad2/3蛋白，活化狀態(tài)的Smad2/3磷酸化Smad4，Smad4將信號(hào)攜帶進(jìn)入細(xì)胞核，并與DNA直接相互作用共同活化或者抑制不同類(lèi)型細(xì)胞，導(dǎo)致活化或者是抑制目的基因[7]。

1.3 Glypican-1/c-Src/MAPK/AKT信號(hào)通路

TDGF1能夠活化撕裂原活化蛋白激酶(ras/raf/MAPK)和磷脂酰肌醇(PI3-K/AKT/GSK-3b)信號(hào)通路。由于在人類(lèi)的幾個(gè)癌細(xì)胞系條件培養(yǎng)液中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可溶性TDGF1存在，很有可能是具有功能的可溶性TDGF1是從細(xì)胞膜自然裂解而來(lái)?；罨@些信號(hào)通路可以獲得無(wú)GPI的可溶性TDGF1重組蛋白，這兩條細(xì)胞內(nèi)通路的激活與癌癥進(jìn)程相關(guān)。除此之外，這兩條通路的活化發(fā)生在TDGF1與磷脂酰肌醇聚糖-1(GPI-1)直接結(jié)合的條件下，作為幾個(gè)不同的生長(zhǎng)因子的共同受體發(fā)揮作用[8]。

2 TDGF1與胚胎發(fā)育及腫瘤的關(guān)系

已有研究表明TDGF1在胚胎發(fā)育階段起到非常重要的作用，尤其在干細(xì)胞更新、多功能型分化和存活方面，同樣在癌癥進(jìn)程中表達(dá)。癌癥進(jìn)展相當(dāng)于胚胎發(fā)育在時(shí)間和空間上的錯(cuò)誤表現(xiàn)。在早期胚胎發(fā)育階段EGF-CFC蛋白作為必不可少的共同受體轉(zhuǎn)化TGF-β家族蛋白信號(hào)，TDGF1與TGF-β家族配體Nodal都是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，而且是人類(lèi)和小鼠胚胎干細(xì)胞未分化的標(biāo)志[9]，在正常成體組織中表達(dá)極少[10]。同樣，TDGF1在胚胎發(fā)育期間被證實(shí)活化Nodal/ALK4非依賴型信號(hào)通路參與結(jié)合GPI-1并且隨后活化兩條細(xì)胞內(nèi)通路[11]。在小鼠的發(fā)育過(guò)程中，在小鼠交配后的第4天的囊胚中TDGF1最早出現(xiàn)在滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，當(dāng)原腸胚形成時(shí)TDGF1在外胚層表達(dá)，之后的發(fā)育中TDGF1的表達(dá)受到高度限制，在第6.5天的囊胚中TDGF1出現(xiàn)在外胚層細(xì)胞中，并且形成中胚層。在囊胚期的第8.5天TDGF1在心肌層表達(dá)。小鼠TDGF1在心前中胚層表達(dá)并且在早期心臟系統(tǒng)分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在多功能胚胎干細(xì)胞中敲除純合體TDGF1基因會(huì)損害胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞的能力，但并未影響胚胎干細(xì)胞分化成其他類(lèi)型的細(xì)胞[12]。敲除TDGF1導(dǎo)致形成的胚胎只有頭部沒(méi)有軀干，表明缺少TDGF1會(huì)導(dǎo)致胚胎中胚層和外胚層存在嚴(yán)重的缺陷但并不會(huì)對(duì)神經(jīng)外胚層的形成造成損害。

在幾種人類(lèi)腫瘤樣本中，如結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌，檢測(cè)到TDGF1的高頻率表達(dá)[13]。也有研究表明，過(guò)表達(dá)TDGF1與小鼠的乳腺癌惡化相關(guān)[14]。TDGF1不僅調(diào)控細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移，而且在腫瘤發(fā)生的各個(gè)階段起到至關(guān)重要的作用[10]。體外試驗(yàn)研究表明，TDGF1具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管生成功能。TDGF1以濃度依賴型方式促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和入侵，并且在基底膜基質(zhì)促進(jìn)血管類(lèi)似結(jié)構(gòu)形成[15]。當(dāng)小鼠乳腺上皮細(xì)胞在涂有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的多孔過(guò)濾器上培養(yǎng)時(shí)，過(guò)表達(dá)的TDGF1不僅可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，趨化和遷移，而且在Ⅰ型膠原蛋白基質(zhì)上形成管道狀結(jié)構(gòu)[2，16]。用小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)刺激小鼠乳腺，發(fā)現(xiàn)TDGF1在乳腺增生和乳腺癌進(jìn)程中過(guò)表達(dá)[17]。在人乳腺癌和小鼠表皮癌中發(fā)現(xiàn)TDGF1與EGF相關(guān)多肽共表達(dá)，表明不同的生長(zhǎng)因子在癌細(xì)胞的自主增殖中能夠相互作用[18]。

3 TDGF1與成肌細(xì)胞及MSTN的關(guān)系

TDGF1是典型的致癌因子，以往的研究多集中在腫瘤發(fā)生、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移方面[3，19]。目前也有報(bào)道TDGF1參與成肌細(xì)胞的增殖分化，但是相關(guān)研究極少。MSTN也被稱為生長(zhǎng)分化因子8(GDF-8)，在骨骼肌中特異性表達(dá)并且作為成肌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控抑素發(fā)揮作用。已有報(bào)道在成年小鼠成肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TDGF1可以調(diào)控MSTN信號(hào)，下調(diào)TDGF1的表達(dá)可減弱MSTN的信號(hào)[20]。對(duì)小鼠的研究表明，過(guò)表達(dá)TDGF1可通過(guò)抑制MSTN信號(hào)而促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖[21]。此外，Adriano Buzzati-Traverso實(shí)驗(yàn)室報(bào)道，小鼠TDGF1可促初級(jí)成肌細(xì)胞有絲分裂，對(duì)成肌細(xì)胞的增殖影響是濃度依賴型。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，TDGF1通過(guò)抑制MSTN的作用，從而修復(fù)骨骼肌損傷并促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞向肌源性細(xì)胞分化[22]。

MSTN與激活素類(lèi)似，通過(guò)細(xì)胞表面受體復(fù)合體(Ⅰ型和Ⅱ型)來(lái)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞起作用。MSTN結(jié)合Ⅱ型絲/蘇氨酸激酶受體ActRIIB之后通過(guò)Ⅰ型受體ALK4(ActRIB)或者ALK5(TGF-β receptor I)[23]。在肌源性細(xì)胞中，TDGF1的表達(dá)是CFC區(qū)與ALK4結(jié)合，激活Smad2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而轉(zhuǎn)化MSTN信號(hào)。EGF和CFC區(qū)對(duì)MSTN的調(diào)控都很重要。在成肌細(xì)胞中敲除TDGF1與敲除ALK4機(jī)制相同，都會(huì)導(dǎo)致MSTN磷酸化減弱，敲除TDGF1導(dǎo)致成肌細(xì)胞發(fā)生分化，這個(gè)觀點(diǎn)支持TDGF1可以控制肌源性細(xì)胞分化[24]。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)TDGF1與MSTN相互作用對(duì)C2C12細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，MSTN通過(guò)TDGF1激活其信號(hào)通路，啟動(dòng)Smad蛋白磷酸化，導(dǎo)致MyoD1基因表達(dá)量顯著下調(diào)從而抑制C2C12細(xì)胞的增殖作用。

4 展望

在目前的研究中，基因敲除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ALK4是Ⅰ型受體在肌源性細(xì)胞中MSTN的主要受體。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TDGF1中的EGF和CFC區(qū)對(duì)MSTN的調(diào)控都是十分重要的，表明TDGF1不僅通過(guò)結(jié)合ALK4來(lái)結(jié)合Ⅱ型受體，也很有可能直接結(jié)合MSTN。未來(lái)的研究應(yīng)該闡明TDGF1和MSTN相互作用的分子機(jī)制，為培育品系優(yōu)良的肉用家畜提供理論依據(jù)。另外，對(duì)MSTN 與TDGF1相互作用機(jī)理的研究，為醫(yī)學(xué)上相關(guān)肌肉萎縮性疾病的治療提供理論依據(jù)。

[1] Park K S, Raffeld M, Moon Y W, et al. CRIPTO1 expression in EGFR-mutant NSCLC elicits intrinsic EGFR-inhibitor resistance[J]. J Clin Invest，2014，124(7):3003-3015.

[2] Giorgio E, Liguoro A, D'Orsi L, et al. Cripto haploinsufficiency affectsinvivocolon tumor development[J]. Int J Oncol，2014，45(1):31-40.

[3] Pilgaard L, Mortensen J H, Henriksen M,et al. Cripto-1 expression in glioblastoma multiforme[J]. Brain Pathol (Zurich, Switzerland)， 2014，24(4):360-370.

[4] Calvanese L, Sandomenico A, Caporale A,et al. Conformational features and binding affinities to Cripto, ALK7 and ALK4 of Nodal synthetic fragments[J]. J Peptide Sci，2015，21(4):283-293.

[5] Aykul S, Ni W, Mutatu W, et al. Human Cerberus prevents Nodal-receptor binding, inhibits nodal signaling, and suppresses nodal-mediated phenotypes[J]. PLoS One,2015,10(1):e0114954.

[6] Gray P C, Vale W. Cripto/GRP78 modulation of the TGF-beta pathway in development and oncogenesis[J]. FEBS Lett,2012,586(14):1836-1845.

[7] Carrarelli P, Yen C F, Arcuri F,et al. Myostatin, follistatin and activin type II receptors are highly expressed in adenomyosis[J]. Fertil Steril,2015,104(3):744-752.

[8] Francescangeli F, Contavalli P, De Angelis M L, et al. Dynamic regulation of the cancer stem cell compartment by Cripto-1 in colorectal cancer[J]. Cell Death Differentiation,2015,22(10):1700-1713.

[9] Bandeira C L, Urban Borbely A, Pulcineli Vieira Francisco R, et al. Tumorigenic factor CRIPTO-1 is immunolocalized in extravillous cytotrophoblast in placenta creta[J]. Bio Med Res Int,2014:892856.doi: 10.1155/2014/892856.

[10] Bianco C, Strizzi L, Ebert A, et al. Role of human cripto-1 in tumor angiogenesis[J]. J National Cancer Institute,2005,97(2):132-141.

[11] Spiller C M, Bowles J, Koopman P. Nodal/Cripto signaling in fetal male germ cell development: implications for testicular germ cell tumors[J]. Int J Develop Biol, 2013,57(2-4):211-219.

[12] Klauzinska M, Castro N P, Rangel M C, et al. The multifaceted role of the embryonic gene Cripto-1 in cancer, stem cells and epithelial-mesenchymal transition[J]. Seminars Cancer Biol,2014;29:51-58.

[13] Rangel M C, Karasawa H, Castro N P, et al. Role of Cripto-1 during epithelial-to-mesenchymal transition in development and cancer[J]. Am J Pathol,2012,180(6):2188-2200.

[14] Strizzi L, Bianco C, Raafat A, et al. Netrin-1 regulates invasion and migration of mouse mammary epithelial cells overexpressing Cripto-1invitroandinvivo[J]. J Cell Sci,2005,118(Pt 20):4633-4643.

[15] Wang Y, Xu C, Wang H, et al. Efficient derivation of human embryonic stem cell lines from discarded embryos through increases in the concentration of basic fibroblast growth factor[J]. Human Cell,2012,25(1):16-23.

[16] Jin J Z, Tan M, Ding J. Analysis of Cripto expression during mouse cardiac myocyte differentiation[J]. Int J Develop Biol,2013,57(9-10):793-797.

[17] Liu T, Wang Y, Peng X,et al. Establishment of mouse teratocarcinomas stem cells line and screening genes responsible for malignancy[J]. PLoS One,2012,7(8):e43955.

[18] Bianco C, Castro N P, Baraty C, et al. Regulation of human Cripto-1 expression by nuclear receptors and DNA promoter methylation in human embryonal and breast cancer cells[J]. J Cell Physiol,2013,228(6):1174-1188.

[19] Wei B, Jin W, Ruan J, et al. Cripto-1 expression and its prognostic value in human bladder cancer patients[J]. Tumour Biol,2015,36(2):1105-1113.

[20] Pistilli E E, Bogdanovich S, Goncalves M D, et al. Targeting the activin type IIB receptor to improve muscle mass and function in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy[J]. Am J Pathol, 2011,178(3):1287-1297.

[21] Ciarmela P, Bloise E, Gray P C, et al. Activin-A and myostatin response and steroid regulation in human myometrium: disruption of their signalling in uterine fibroid[J]. J Clin Endocrinol Metabol,2011,96(3):755-765.

[22] Guardiola O, Lafuste P, Brunelli S, et al. Cripto regulates skeletal muscle regeneration and modulates satellite cell determination by antagonizing myostatin[J]. Proceed Nat Acad Sci USA,2012,109(47):E3231-40.

[23] Rebbapragada A, Benchabane H, Wrana J L, et al. Myostatin signals through a transforming growth factor beta-like signaling pathway to block adipogenesis[J]. Mol Cell Biol,2003,23(20):7230-7242.

[24] Kemaladewi D U, de Gorter D J, Aartsma-Rus A, et al. Cell-type specific regulation of myostatin signaling[J]. FASEB J,2012,26(4):1462-1472.

Introduction to Advance in TDGF1 Gene

YANG Xue1，WANG Jun2，LIU Hong-yu2，LYU Wen-fa2

(1.AnimalReproductionBiotechnologyResearchCenter，CollegeofLifeScience，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin,130118，China；2.AnimalReproductionBiotechnologyResearchCenter，CollegeofAnimalScienceandTechnology，
JilinAgriculturalUniversity，Changchun,Jilin,130118，China)

TDGF1 is a small molecule sugar-based phosphatidyl inositol (GPI) binding protein for regulation of cell proliferation, survival, differentiation and migration. It is generally not in normal tissue expression but only part of the system of a small amount of expression which is expressed in a wide variety of tumor cells significantly. Previous reports of TDGF1 focused on tumor and early embryonic development. Conversely, recent studies have found that TDGF1 through regulating the MSTN signal is involved in myoblast proliferation and differentiation.In the cells with significant expression of Cripto, such as myogeniccells, the CFC domain of Cripto is associated to ALK4, thereby transducing myostatin signaling.When TDGF1 is down-regulated,myostatin signaling is decreased,demonstrating the importance of TDGF1 in myostatin-controlled responses in myogenic cells. Furthermore, both the EGFand CFC domains of TDGF1 seem to be important in modulating myostatin signaling. The current review was aimed at molecular basis of the TDGF1 and its effect on differentiation of myoblast proliferation.

TDGF1；signaling pathway；myostatin；myoblast

2015-11-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172227)；吉林省現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(201534)

楊 雪(1988-)，女，吉林吉林人，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。 *通訊作者

S857.2；Q74

A

1007-5038(2016)05-0112-04