劉娟

治療性HBV DNA疫苗的研究及進展

劉娟

HBV DNA疫苗是通過向體內遞送編碼HBV抗原的外源性重組質粒，刺激機體產生特異的體液免疫反應和細胞免疫反應，由于其能較好的誘發(fā)Th1型細胞介導的細胞毒反應，而且同蛋白質疫苗相比設計相對簡單，生產高純度產品所需成本更低，因此DNA疫苗成為對慢性乙肝進行免疫治療的一種選擇，它不僅可作為預防性疫苗，也可作為治療性疫苗，在乙型肝炎預防和治療中具有廣闊的應用前景。

慢性乙型病毒性肝炎；DNA疫苗；免疫反應

全世界約有2.4億例慢性乙型肝炎（簡稱乙肝）病毒（HBV）慢性攜帶者[1]。我國屬于HBV感染的高流行區(qū)，乙肝表面抗原檢出率約10%，其中慢性乙型肝炎患者約3千萬人。對此類患者目前公認有效的藥物包括干擾素和核苷酸類似物，但前者有效率僅為10%～30%且不良反應大，后者療效短暫并易產生耐藥，故常導致患者病情遷延不愈，每年有65萬患者死于肝衰竭、肝硬化、肝癌[2]。盡管利用計劃免疫控制乙肝已成為世界各國的共識，然而在接種乙肝疫苗的健康人群中約有5%～10%的人表現(xiàn)為對疫苗抗原的無應答或弱應答[3]，不能產生保護力水平的抗體。因此，研制新的疫苗或藥物去抑制和消除HBV，降低肝臟失代償、肝硬化和肝癌發(fā)病率成為目前急需解決的問題。1993年，Mancini等[4]報道HBV DNA疫苗免疫的HBV Tg小鼠血清HBsAg滴度明顯下降或完全清除，發(fā)現(xiàn)乙肝DNA疫苗在誘導機體體液免疫和細胞免疫反應的優(yōu)勢后，HBV-DNA疫苗就作為一種針對慢性乙肝的具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。

1 HBV DNA疫苗的作用機制及治療依據

HBV DNA疫苗接種機體后目的基因的表達產物系內源性抗原，激發(fā)體液、細胞免疫機制而達到防治乙型肝炎的目的。

DNA疫苗（質粒）在注射部位被細胞攝取后通過轉錄翻譯生成蛋白質，蛋白質通過胞內處理后．把信息遞呈給I類MHC限制性CD8+T細胞，表達I類MHC分子或共刺激分子。攝取質粒的細胞能分泌釋放抗原，刺激B細胞生成抗體。同時抗原被

APC細胞（抗原遞呈細胞）攝取，通過Ⅱ類MHC分子，遞呈給

CD4+T細胞和B細胞，識別病毒感染的細胞。在此過程CTL（細胞毒性T淋巴細胞）介導細胞免疫對病毒感染預防起著重要的作用[4]。CTL能識別細胞表面的病毒蛋白，通過感染細胞的細胞溶解機制和通過細胞因子非細胞溶解機制來完成。CTL能針對病毒抗原決定簇產生交叉反應，故能針對不同細胞株而產生較強保護作用[5]。研究證實，發(fā)生乙肝慢性化的主要原因是慢性患者CTL反應低下，而治療慢性乙肝的根本在于提高針對

HBV的特異性細胞免疫水平，激活特異性CTL，并使其長期維持，清除慢性感染患者體內的HBV[6]，打破對HBV的免疫耐受。Webster等[7]發(fā)現(xiàn)在不損傷肝細胞的情況下，CTL通過細胞接觸和釋放細胞因子激活細胞自身抗病毒機制也可達到清除HBV DNA核殼蛋白和DNA復制中間體的目的，這一發(fā)現(xiàn)為治療性HBV DNA疫苗的應用進一步提供了依據。

2 抗原編碼基因的選擇

HBsAg含有誘導機體產生HBV中和抗體的抗原決定簇，可以很快誘導出體液和細胞免疫反應，是首選目的基因。前S2抗原中存在T細胞激活表位，免疫原性強，與S抗原聯(lián)用能夠提高機體對HBsAg的抗體應答水平，克服亞單位疫苗無應答現(xiàn)象。

HbcAg/HBeAg基因是HBV DNA疫苗的另一重要基因。HBcAg是具有高度免疫原性的人類T細胞抗原，可以誘導出MHC I類限制性CTL反應。胞內HbeAg前體與HBcAg有70%的共同序列，可以通過MHC I類、Ⅱ類抗原路徑被CD4+T細胞識別，胞內共表達HBeAg會使受染肝細胞更易被HBeAg/ HBcAg特異性T細胞發(fā)現(xiàn)[8]。

3 DNA疫苗的導入

DNA疫苗在小型實驗動物體內有較強的誘發(fā)免疫反應的潛力，但在大多數(shù)大型實驗動物中免疫反應較為緩和并且短暫，這可能與轉入的質粒基因表達水平較低有關。關于DNA疫苗體內導入的研究發(fā)展很快，從最初的直接肌肉注射到基因槍接種，再發(fā)展到近幾年出現(xiàn)的電穿孔技術，質粒DNA的體內遞送效率顯著提高，其中電穿孔導入技術利用電離使細胞膜上出現(xiàn)短時的多個孔道以增加質粒的導入量，而且還造成了細胞因子的表達上調和炎細胞浸潤，從而促進免疫系統(tǒng)的激活，它因兼?zhèn)涓咝А踩?、操作簡便和低成本等多項特質[9-10]，成為DNA疫苗導入的首選方案。

4 DNA疫苗的動物實驗

1996年Mancini等發(fā)現(xiàn)，單次HBsAg DNA免疫HBV轉基因（Tg）小鼠，其外周血中HBsAg顆粒完全消失并持續(xù)5個月以上，肝組織中HBV mRNA的表達下降，脾細胞過繼轉移試驗證實這一作用是由CD4+Th1細胞和CD8+CTL共同介導的，表明DNA疫苗誘導的CTL免疫應答對清除體內持續(xù)性病毒感染有療效[11]。

Kuhober等用編碼HbcAg和HBeAg基因的DNA疫苗免疫小鼠，均可有效誘導產生特異性抗體應答和CTL應答，且反應強度相當。Huang ZH[12]用HBcAg DNA疫苗免疫獼猴，結果產生高滴度抗HBc IgG亞類以IgG2占優(yōu)勢，免疫反應偏向于Th1型。

基因佐劑的應用可從更深層次上提高機體對HBV DNA疫苗的免疫應答。IL-2[13]、IL-12[14]、IL-22[15]等TH1型細胞因子的基因聯(lián)合DNA疫苗免疫能影響Th1細胞的分化，以及免疫反應的類型，可更好地增強免疫效果，起到良好的佐劑作用。

5 DNA疫苗的臨床研究

1999年Tacket等[16]對7名健康志愿者進行了HBsAg DNA疫苗的安全性及耐受性測試，使用PowderJectXR1裝置將HBsAgDNA疫苗接種到受試者皮下，所有志愿者耐受性良好，未報導明顯不良反應，其中6名產生了持久的HBsAb，1名未產生抗體者經回顧調查認為既往曾接觸過HBV。本次試驗發(fā)現(xiàn)小劑量（0.25 mg）不能誘導體液免疫，8周以后經過加強方誘導出HbsAb。由此可見HBV DNA疫苗可作為健康人乙肝的預防性疫苗。

2003年Rottinghaus等[17]使用PMED系統(tǒng)（particle 2 mediated epidermal delivery）對16位常規(guī)乙肝疫苗接種后無反應的健康志愿者進行HBV DNA疫苗接種（這16位志愿者接受過正規(guī)的3次亞單位疫苗接種），其中12位產生了持久的保護性抗體反應，進一步顯示出HBVDNA疫苗在疫苗接種后無反應或低反應者中的優(yōu)勢。

2004年法國巴斯德研究所的Mancini-Bourgine等[18]應用編碼preS2/S蛋白的重組質粒免疫10例慢性乙肝病毒攜帶者。結果發(fā)現(xiàn)，疫苗能夠被慢性乙肝病毒攜帶者很好地耐受。有2例攜帶者的PBMC發(fā)生抗原特異性的T淋巴細胞增殖反應，并且抗HBV特異性分泌IFN-γ的T細胞數(shù)目在免疫后有較大幅度的提高。有5例攜帶者的血清HBV DNA水平下降，但是這種下降僅僅是暫時性的。研究者隨后設計了臨床Ⅰ期試驗來評價表達HBsAg和preS2/S的DNA疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。10例HBeAg陽性的慢性乙肝患者接受了DNA疫苗的治療后耐受性較好，經3次疫苗注射后，全部患者產生了特異性抗HBsAg的分泌IFN-γ型T細胞，50%患者產生了抗preS2抗原的T細胞。研究證明了治療性DNA疫苗的安全性和免疫效率，并且說明DNA疫苗接種能在部分慢性HBV攜帶者體內誘導特異性T細胞反應，顯示出HBV DNA疫苗作為治療慢性乙型肝炎的有效工具的潛力。

對慢性乙肝患者而言，一個合理的治療策略可以包括抗病毒藥物對病毒復制的直接抑制作用以幫助恢復T細胞的反應性，以及疫苗強有力的外源性刺激來引發(fā)B細胞和T細胞反應。而將治療性疫苗同其他抗病毒藥聯(lián)合使用較好的體現(xiàn)了這一策略，同時這一策略也在一些動物實驗及臨床試驗中得到了證實。如在鴨感染鴨乙型肝炎病毒的早期階段進行核酸類似物恩替卡韋（ETV）的治療，可阻止DHBV的擴散并導致50%的鴨的病毒肝細胞徹底清除，Miller等[19]聯(lián)合使用ETV和表達PreS/S抗原的DNA疫苗對感染的鴨進行治療，發(fā)現(xiàn)感染后67天時，全部感染的鴨都清除了病毒，停藥后也無復發(fā)；而對照組采用ETV和空白DNA載體治療，結果仍有60%病例在ETV停用后感染擴散。Yang SH等[20]將4種HBV的質粒（pGX10S+pGX10S1/ S2/X+pGX10core+pGX10Po1）混合與pGX10hIL-12N222L為佐劑一起免疫，每月1次，并口服拉米夫定100 mg/d，聯(lián)合治療12例CHB患者，治療結束隨訪12個月后50%HBV DNA轉陰，而且耐受性良好。同時進行的ELISPOT檢測表明Thl細胞反應，尤其是CD4+記憶T細胞反應至少可以維持40周。

我國食品藥品監(jiān)督局首個批準應用于臨床研究的治療性

DNA疫苗為雙質粒乙肝DNA疫苗，它是以編碼HBV抗原蛋白preS2+S的真核表達質粒pS2.S作為疫苗，人IL-2和

IFNγ融合蛋白的質粒作為佐劑，通過在體電脈沖技術肌內注射給藥。在Ⅰ期試驗中，30名健康志愿者都未出現(xiàn)不良反應，證明該疫苗有較好的安全性和耐受性[21]。Ⅱa期試驗是據轉氨酶水平將CHB患者分為2組：n1組為轉氨酶水平比正常水平高1～2倍，只接受DNA疫苗治療（n1=6）；n2組為轉氨酶水平高于正常水平2倍以上（n2=33），隨機按1∶2比例接受LAM+安慰劑（對照組）或LAM+DNA疫苗（治療組）治療。結果表明：n1組即低轉氨酶患者組產生特異性分泌IFNγ的T淋巴細胞，DNA疫苗能夠有效誘導抗HBV特異性細胞免疫應答。另一組中接受

LAM+DNA疫苗的患者在36周時可測得HBV DNA抑制率比LAM+安慰劑患者高，在第60周時差異有統(tǒng)計學意義（90.9% vs 54.5%，P=0.030）；且HBV基因耐藥雙位點變異（rtM204V/ I/S+rtL180 M）發(fā)生例數(shù)較后者少，差異有統(tǒng)計學意義（4.5% vs 36.4%，P=0.030）；與LAM+安慰劑對照組比較，LAM+DNA疫苗治療組顯示較低的病毒學突破率（P=0.030）和更高的HBV特異性T淋巴細胞免疫應答率[22]。為進一步證明LAM+DNA疫苗治療組的有效性和安全性，研究者將樣本例數(shù)擴大至225例進行Ⅱb臨床多中心隨機雙盲試驗，目前數(shù)據顯示：同前一樣，在血清HBV DNA抑制率和HBeAg轉換率中治療組優(yōu)于對照組。HBV DNA抑制率在48周時差異有統(tǒng)計學意義（10.3% vs 3.5%，P=0.044）。在第72周時，治療組具有較高的HBeAg轉換率（54.5% vs 15.8%，P=0.040），差異有統(tǒng)計學意義，提示雙質粒

HBV DNA疫苗可誘導較強的病毒特異性T淋巴細胞免疫應答。

韓國浦項（Pohang）科技大學開發(fā)HB100 DNA疫苗，包括了5個表達所有HBV抗原蛋白和IL212的pGX10質粒[pGX10S（2 mg）+pGX10S1/S2/X（1.5 mg）+pGX10core（1.5mg）+pGX10Pol（1 mg）+pGX10h IL212N222L（2 mg）]，研究者制定12例慢乙肝患者先接受拉米夫定治療8周，再予HB-100疫苗治療的方法，目的為觀察疫苗和拉米夫定連用是否抗原特異免疫反應，拉米夫定停藥后T細胞反應是否抑制病毒反彈，為臨床I期，結果表明DNA疫苗和拉米夫定聯(lián)用患者耐受性好，有50%的患者病毒滴度降低，伴隨產生HBV特異性分泌

IFN2γ的T細胞，CD4+記憶性T細胞在治療結束40周后仍檢測到，但該臨床試驗沒有設對照[23]。

比利時Innogenetics公司利用Epim2mune公司的多表位技術開發(fā)HBV多表位DNA疫苗，已經在美國完成I期臨床。疫苗包含一個編碼30個HBV CTL表位和16個Th表位的

DNA載體，這些表位預期能被95%的HLA人群的T細胞識別。研究目的是DNA多表位疫苗的安全性和耐受性研究，肌內注射0.4 mg或4 mg劑量疫苗，12周內每4周注射1次，共4次，在所有健康的受試者中安全且耐受性好[24]。

從上看出，目前乙肝DNA疫苗的研制主要圍繞多表位、多載體，增加免疫佐劑等方面，而2015年韓國研究者做了一項新的嘗試，將HB-100改進為HB-110，并將改進后的HB-110導入韓國患者，同時將HB-100導入白人患者，結果表明前者比后者表現(xiàn)出更弱的誘導HBV特異性T細胞應答和血清轉換的能力[25]。作為亞洲患者，一般通過母嬰垂直傳播感染的患者，似乎比白人有更高的免疫耐受水平，所以要開發(fā)有效的治療HBV DNA疫苗的新方法，比起增強免疫原性，打破免疫耐受可能更迫切需要。

6 結語

慢性乙型肝炎是危害人民身體健康的重大傳染病，目前使用的藥物僅能抑制病毒復制，不能徹底清除病毒。免疫治療成為慢乙肝治療的一個重要手段，而如何有效、全面地激發(fā)患者的免疫系統(tǒng)，重建對乙型肝炎病毒的免疫力，可能是消除慢性感染的關鍵。乙肝DNA疫苗，無論是編碼表面抗原還是編碼核心抗原，均可誘導出HBV特異性的CTL反應。

DNA疫苗的免疫保護作用已得到公認，與核苷類似物的聯(lián)用在臨床試驗上也被證實能提高HBV-DNA陰轉，HBeAg血清學轉換率，在部分慢乙肝患者體內誘導特異性免疫反應，使治療性HBV-DNA疫苗有望成為新的治療策略。但HBV-DNA疫苗要在臨床上廣泛應用，還有很長的路要走。DNA疫苗還有很多環(huán)節(jié)需要深入的探討和研究如HBV DNA疫苗療程的選擇，增強免疫原及其接種的時機的選擇，與何種抗病毒藥物聯(lián)用、時機選擇、如何實現(xiàn)個體化治療等。由于DNA疫苗轉染率較低，免疫反應起效慢，效果較弱，如何更好地提高HBV特異性免疫應答的強度，并延長其持續(xù)時間，均是治療性HBV-DNA疫苗研究和開發(fā)過程中亟待解決的問題。而DNA疫苗研究時間較短，已完成的臨床研究不多，而且其作用機制尚不十分清楚，但隨著分子生物學和免疫學等相關科學的發(fā)展，相信在不久的將來，治療性HBV DNA疫苗在經過不斷改善提高后將為人類根治乙肝起到重要作用。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.32.006

江西 341000 贛州市人民醫(yī)院感染性疾病科（劉娟）