李格賓，楊紫嫣，夏兆飛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

?

犬肥大細胞瘤診斷方法研究進展

李格賓△，楊紫嫣△，夏兆飛*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

肥大細胞瘤是犬最常見的皮膚腫瘤，其惡性率和轉(zhuǎn)移率都較高，因此，探尋診斷、治療犬肥大細胞瘤的新型有效方法就顯得十分必要。論文詳細介紹了兩種診斷犬肥大細胞瘤的病理學(xué)分級體系,即Patnaik分級體系與Kiupel分級體系，同時解釋了c-kit基因的生理作用及診斷價值，介紹了國外常用的犬肥大細胞瘤c-kit基因突變診斷方法，重點闡述了c-kit基因突變與犬肥大細胞瘤診斷、病理學(xué)分級、治療方案的確定及預(yù)后的關(guān)系，以期能對我國小動物臨床的醫(yī)生和科研工作者有所啟發(fā)。

犬;肥大細胞瘤；診斷方法

肥大細胞瘤(mast cell tumor，MCT)是犬發(fā)生率最高的皮膚腫瘤，占所有皮膚腫瘤的16%～21%，其惡性率達19%～39%，其高發(fā)年齡為7歲以上[1]。低分化的MCT(high grade)轉(zhuǎn)移率在55%～96%，一般最先轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，隨后轉(zhuǎn)移至脾臟和肝臟，最后轉(zhuǎn)移至骨髓，此時在外周血液中會發(fā)現(xiàn)大量肥大細胞，稱為肥大細胞血癥。MCT中大量肥大細胞向血液中釋放的組胺、肝素及其他血管活性物質(zhì)會導(dǎo)致患犬出現(xiàn)一系列臨床癥狀，例如過量組胺導(dǎo)致十二指腸潰瘍，機械刺激腫瘤導(dǎo)致腫瘤周圍出現(xiàn)浮腫和紅斑，嚴重時還會導(dǎo)致患犬發(fā)生低血壓或嘔吐等急性全身癥狀，如過敏性休克，大多數(shù)患犬在發(fā)現(xiàn)腫瘤后1年內(nèi)死亡[2-3]，因此患有惡性MCT的犬無論是生存期還是生存質(zhì)量都不盡如人意。對于局部單發(fā)且無遠端轉(zhuǎn)移的MCT患犬，一般會采用手術(shù)結(jié)合放療的治療方法，但是由于昂貴的放療設(shè)備和治療費，該治療方法目前不能被廣大動物醫(yī)院和寵物主人所接受。而對于患有遠端轉(zhuǎn)移或侵襲性很強的MCT患犬來說，則需采取化學(xué)療法。傳統(tǒng)化療藥物的主要作用機制是利用腫瘤細胞比正常細胞生長活躍的特點，通過阻斷腫瘤細胞DNA的合成周期來起作用，所以在殺死腫瘤細胞的同時也會損傷其他分裂速度快的細胞(如骨髓中的造血干細胞和胃腸道上皮細胞)，引發(fā)各種副作用如骨髓抑制和胃腸道功能紊亂等。近些年，多項研究和臨床病例報告均報道了分子靶點藥物對犬MCT的療效，這一新型治療方法引起了人們的廣泛關(guān)注，但是分子靶點藥物并非對所有MCT均有效，其僅對發(fā)生了c-kit基因突變的MCT治療有效，因此分子學(xué)診斷方法可以大幅度提高分子靶點藥物治療犬MCT的有效率。如今，我國的小動物臨床也逐漸開始建立MCT分子學(xué)診斷方法，下面對犬MCT診斷方法的相關(guān)研究進展做一概述。

1 組織病理學(xué)診斷

1.1 Patnaik病理學(xué)分級體系

該分級體系是在1984年由Patnaik A K等[4]通過對83例手術(shù)切除的MCT進行病理學(xué)分級，并且在隨后3年跟蹤調(diào)查該83只犬的生存時間所得出的。在該系統(tǒng)中，Ⅰ級 MCT 的肥大細胞分化良好；在真皮膠原纖維中呈整齊散在排列；胞漿空間充裕，充滿顆粒；核染色質(zhì)濃縮；無明顯的核仁和有絲分裂細胞。Ⅱ級 MCT 的肥大細胞分化良好；胞漿空間充裕，充滿顆粒；輕度的細胞異型性；一些多孔的細胞核核仁明顯，核仁有的呈皰狀；有絲分裂的細胞數(shù)量適中。Ⅲ級MCT的肥大細胞細胞質(zhì)模糊；中度至重度異型性；細胞核深染，核仁明顯；可見有絲分裂細胞。

隨后的生存率調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在1500d內(nèi)Ⅰ級 MCT 患犬的存活率是Ⅱ級的16倍，Ⅱ級 MCT患犬的存活率是Ⅲ級的5倍[4]；另有研究報道，Ⅰ 級 MCT的轉(zhuǎn)移率低于10%，Ⅱ級為5%～22%，Ⅲ級為80%[5]。由此可見，MCT的病理學(xué)分級越高，患犬存活時間越短，腫瘤轉(zhuǎn)移率越高。

1.2 Kiupel病理學(xué)分級體系

由于不同病理學(xué)家使用 Patnaik 分級體系界定MCT分級的條件并不十分一致，有時會造成對MCT病理學(xué)分級的混亂。為了增強對MCT病理學(xué)分級的一致性，Kiupel M等[6]28位組織病理學(xué)專家對95例MCT樣品進行雙盲試驗。他們認為在Ⅰ級與Ⅱ級之間缺乏顯著的界定條件，并且綜合Ⅰ級與Ⅱ級MCT患犬的存活率數(shù)值，他們認為應(yīng)將Ⅰ級與Ⅱ級統(tǒng)一合并為低等級。隨后該分類法被命名為Kiupel病理學(xué)分級體系，并將MCT組織分為高等級和低等級兩級。高等級必須同時滿足如下條件：在10個高倍視野(high-power field，HPF)內(nèi)至少可見7個細胞有絲分裂相；在10個HPF中至少可見3個多核細胞(3個細胞核以上)；在10個HPF中至少可見3個異常的細胞核；并有巨核細胞出現(xiàn)。

隨后使用Kiupel 病理學(xué)分級體系顯示,高等級的MCT患犬具有更高的病死率和腫瘤轉(zhuǎn)移率，并且患犬存活時間和腫瘤轉(zhuǎn)移所需時間都更短[6]。根據(jù)Sabattini S等人(2015)對137例犬MCT組織病理學(xué)研究表明,Kiupel分級法對診斷犬皮膚MCT更有診斷價值，并且他們認為僅用組織病理分級這一種診斷方法并不能將疾病的預(yù)后把握完全，還需輔助以分子診斷方法，這樣才能獲得更加精確、完整的診斷結(jié)果[7]。同時，Scarpa F等[8]認為細胞學(xué)檢查結(jié)果也可作為腫瘤分級的參考標(biāo)準(zhǔn)之一，可以為隨后進行的手術(shù)或其他治療方案提供更多的信息，該研究結(jié)果顯示了細胞學(xué)與組織學(xué)之間具有強烈的相關(guān)性，但對于一些高分級的MCT仍存在細胞學(xué)與組織學(xué)結(jié)果不一致的情況。

組織病理學(xué)是診斷MCT的金標(biāo)準(zhǔn)，其分級體系對MCT治療方案的確定和預(yù)后都起著至關(guān)重要的作用。Patnaik病理學(xué)分級體系目前廣泛用于歐美等發(fā)達國家，而國外對Kiupel分級體系的認可度較有限，其常作為Patnaik分級體系的輔助指標(biāo)。隨著國內(nèi)小動物臨床診療技術(shù)的發(fā)展，建立規(guī)范的病理分級制度是非常有必要的，它可為MCT患犬提供精確的診斷，為進一步治療打下堅實基礎(chǔ)。

2 c-kit基因突變診斷

2.1 c-kit基因及KIT蛋白

c-kit 基因編碼 Ⅲ 型酪氨酸激酶跨膜受體(KIT)，它的配體是干細胞因子(stem cell factor，SCF)。這種受體蛋白在結(jié)構(gòu)上主要包括3個部分：①5個膜外免疫球蛋白樣區(qū)域，由外顯子(exon)1～9編碼；②跨膜區(qū)，由exon10編碼；③膜內(nèi)區(qū)，由exon11～21編碼。膜內(nèi)區(qū)又可以分為負調(diào)控因子近膜區(qū)與細胞質(zhì)酪氨酸激酶區(qū)，負調(diào)控因子近膜區(qū)由exon11和12編碼，細胞質(zhì)酪氨酸激酶區(qū)又被分解為 ATP 結(jié)合區(qū)(exon13)和轉(zhuǎn)磷酸酶小環(huán)區(qū)(exon17)[9]。像其他酪氨酸受體那樣，只有捆綁配體(SCF)才能導(dǎo)致受體(KIT)二聚化，隨后激活酪氨酸激酶，最終使細胞啟動自動磷酸化與外源性基質(zhì)的磷酸化，這些磷酸化作用將會引起下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活細胞內(nèi)信號通路如：Shc/Ras/MAOK,JAK/STAT 和 PI3K 級聯(lián)反應(yīng)[9-10]。c-kit 受體信號在紅細胞生成、淋巴細胞生成、肥大細胞的成熟和功能完善、巨核細胞生成、配子生成、黑色素生成中具有重要作用[11]。c-kit基因主要在浦肯野氏纖維和星形膠質(zhì)細胞中表達，而對于起源于造血干細胞的細胞來說，肥大細胞是唯一過度表達這種蛋白的細胞類型，正常情況下，肥大細胞的生長、成熟、增殖大部分由KIT 蛋白所調(diào)控；另外，c-kit 基因在哺乳動物中是高度保守的，比如犬與人類和小鼠的c-kit 基因相似度分別為88%和82%[12]。

2.2 c-kit 基因突變

隨著分子學(xué)研究方法逐漸應(yīng)用于小動物臨床，歐美及日本等國家研究發(fā)現(xiàn)，有將近15%～40%的犬MCT包含c-kit基因突變，目前發(fā)現(xiàn)的突變包括點突變、內(nèi)部序列重復(fù)突變(internal tandem duplication，ITD)和堿基缺失突變[9,13]。在諸多犬MCT的病例中，已經(jīng)確認的突變位點有c-kit表達的膜外區(qū)(exon8和exon9)、近膜區(qū)(exon11)和轉(zhuǎn)磷酸酶小環(huán)區(qū)(exon17)。這些突變(c-kit激活性突變)導(dǎo)致 KIT 蛋白無需依賴配體(SCF)，自身即可持續(xù)磷酸化[9]。KIT蛋白異常磷酸化會導(dǎo)致下游信號不受控制，最終引起細胞增殖與凋亡周期失控，已有大量文獻證實 c-kit突變與犬MCT的發(fā)生、發(fā)展有顯著關(guān)系[14]。

已發(fā)現(xiàn)的犬突變位點中exon11的突變率最高，占突變總數(shù)的14%～21%[15]，另有文獻認為高達64%[9]；exon8突變率約為4.7%，exon9突變率約為4.2%，其他exon的突變均小于3%[15]。在exon8、9、11的突變中，exon8大部分為ITD突變，極少數(shù)為點突變；exon9全部為點突變；exon11大部分為ITD突變(占突變總數(shù)9%～17%[15])，極少數(shù)為點突變和堿基缺失突變；exon17全部為堿基缺失突變[9]。

2.3 c-kit 基因突變檢測方法

國外小動物臨床c-kit基因突變檢測通常采取的方法是：對臨床收集的MCT組織細胞提取基因組DNA，隨后進行PCR擴增，將樣品PCR產(chǎn)物與野生未突變和已知突變的基因組作對比，最后判定是否產(chǎn)生突變及突變位點[12,16]。由于exon11突變率較高，國外文獻中關(guān)于未突變exon11基因大小的敘述較一致(190bp)，若exon11發(fā)生ITD突變，且突變條帶大小約為250bp，那么在電泳結(jié)果中可見2個條帶[17]。

在歐美及日本小動物臨床MCT的診療中，分子學(xué)診斷方法因操作簡單、快速、成本低廉，并且可為臨床用藥提供依據(jù)，c-kit基因突變檢測已成為所有MCT病例常規(guī)檢查的一部分，但我國尚未開展此項檢查。本文通過對國外最新c-kit突變基因的相關(guān)研究的總結(jié)，以期為國內(nèi)小動物臨床提供新的視野。

3 c-kit 基因突變與病理學(xué)分級的關(guān)系

早在2002年，Zemke D等[18]研究就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)c-kit基因突變，特別是近膜區(qū)(exon11)ITD突變與 MCT 病理分級Ⅲ級呈顯著相關(guān)性。隨后Downing S等[19]的研究認為發(fā)生c-kit基因ITD突變的MCT與其惡性程度呈現(xiàn)緊密相關(guān)性。統(tǒng)計表明c-kit基因突變在Ⅱ級、Ⅲ級MCT中的發(fā)生率較相似，并且會導(dǎo)致更高的原位復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。Passantino L等[20]運用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，發(fā)生c-kit突變的肥大細胞越多，由其組成的MCT所表現(xiàn)出的侵害性越強。Schlieben P等[21]的研究發(fā)現(xiàn),唯有exon11ITD突變與Kiupel病理分級系統(tǒng)中高等級的相關(guān)性很顯著。隨后，Takeuchi Y等[13]研究也證實了這一點，同時他們還證實了Zemke D等研究結(jié)果,exon11ITD 突變與Patnaik分級系統(tǒng)中的Ⅲ級MCT呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。而c-kit基因其他突變位點的病例相對較少，其與MCT病理學(xué)分級的關(guān)系尚未得到證實。

4 c-kit 基因突變與存活率及存活時間的關(guān)系

Webster J D等[22]研究表明，存在exon11ITD 突變的患犬，其生存期與腫瘤復(fù)發(fā)間隔時間明顯縮短；與腫瘤相關(guān)的死亡率、原位復(fù)發(fā)率和其他位置轉(zhuǎn)移率明顯上升。為了進一步確定c-kit 基因突變與存活率的關(guān)系，Takeuchi Y等研究發(fā)現(xiàn),除了exon11的ITD 突變與腫瘤無進展存活期(progression free survival，PFS)呈顯著相關(guān)性，其他c-kit 基因突變位點與存活期并無顯著相關(guān)性。

5 小結(jié)

由于犬MCT的發(fā)生率、惡性率和轉(zhuǎn)移率都較高，因此對于惡性MCT的患犬，目前的傳統(tǒng)治療方法很難達到理想的效果，而過于激進的治療方法也會導(dǎo)致患犬生活質(zhì)量嚴重下降，雖然腫瘤多肽疫苗是抗腫瘤藥物領(lǐng)域目前的研究熱點，但仍停留在試驗階段[23]，所以尋找診斷、治療MCT的新型有效方法就變得十分緊迫。分子靶點藥物由于其效率高、副作用小已被國內(nèi)外越來越多的獸醫(yī)師所重視，雖然還有很多有待進一步研究的方面，但是分子靶點藥物治療方法必定會成為小動物臨床未來的主要發(fā)展方向之一?？紤]到分子靶點藥物價格較昂貴，盲目地使用會造成很大浪費，因此必須在使用該藥物前進行c-kit基因突變檢測，根據(jù)檢測結(jié)果制定的治療方案會使分子靶點藥物有的放矢、效果更加確實。綜上所述，在我國小動物臨床開展犬MCT的c-kit基因突變檢測診斷是十分有意義且必要的。

希望這篇論文能對我國小動物臨床醫(yī)生和科研工作者有所啟發(fā)，使我國患MCT的犬貓也能早日受惠于c-kit基因突變檢測帶來的更加具有針對性的治療方案。

[1] 黃平華，李美霞，楊 軍，等.38例犬腫瘤的病理診斷及分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展.2014,35(12): 178-181.

[2] Withrow S J,Vail D M .Small Animal Clinical Oncology[M].Sanuders,2012: 335-346.

[3] Takeuchi Y,Fujino Y,Watanabe M,et al.Aberrant autophosphorylation of c-Kit receptor in canine mast cell tumor cell lines[J].Vet Immunol Immunopathol,2010,137(3-4): 208-216.

[4] Patnaik A K,Ehler W J,MacEwen E G.Canine cutaneous mast cell tumor: morphologic grading and survival time in 83Dogs[J].Vet Pathol,1984,21(5):469-474.

[5] Blackwood L,Murphy S,Buracco P,et al.European consensus document on mast cell tumors in dogs and cats[J].Vet Comp Oncol,2012,10(3): e1-e29.

[6] Kiupel M,Webster J D,Bailey K L,et al.Proposal of a 2-Tier histologic grading system for canine cutaneous mast cell tumors to more accurately predict biological behavior[J].Vet Pathol,2011,48(1): 147-155.

[7] Sabattini S,Scarpa F,Berlato D,et al.Histologic grading of canine mast cell tumor: is 2better tThan 3?[J].Vet Pathol,2015,52(1): 70-73.

[8] Scarpa F,Sabattini S,Bettini G.Cytological grading of canine cutaneous mast cell tumors[J].Vet Comp Oncol,2014: 1-4.

[9] Letard S,Yang Y,Hanssens K,et al.Gain of function mutations in the extracellular domain of KIT are common in canine mast cell tumors[J].Mol Cancer Res,2008,6(7): 1137-1145.

[10] Gilfillan A M,Rivera J.The tyrosine kinase network regulating mast cell activation[J].Immunol Rev,2009,228(1): 149-169.

[11] Roskoski R.Structure and regulation of Kit protein-tyrosine kinase-the stem cell factor receptor[J].Biochem Biophys Res Commu,2005,338(3): 1307-1315.

[12] Sailasuta A,Ketpun D,Piyaviriyakul P,et al.The relevance of CD117-immunocytochemistry staining patterns to mutational exon-11in c-kit detected by PCR from fine-needle aspirated canine mast cell tumor cells[J].Vet Med Int,2014,2014: 1-8.

[13] Takeuchi Y,Fujino Y,Watanabe M,et al.Validation of the prognostic value of histopathological grading or c-kit mutation in canine cutaneous mast cell tumors: a retrospective cohort study[J].Vet J,2013,196(3): 492-498.

[14] Welle M M,Bley C R,Howard J,et al.Canine mast cell tumors: a review of the pathogenesis,clinical features,pathology and treatment[J].Vet Dermatol,2008,19(6): 321-339.

[15] Bonkobara M.Dysregulation of tyrosine kinases and use of imatinib in small animal practice[J].Vet J,2014,205(2):180-188.

[16] Yamada O,Kobayashi M,Sugisaki O,et al.Imatinib elicited a favorable response in a dog with a mast cell tumor carrying a c-kit c.1523A>T mutation via suppression of constitutive KIT activation[J].Vet Immunol Immunopathol,2011,142(1-2): 101-106.

[17] Ketpun D,Sailasuta A,Piyaviriyakul P,et al.Rapid evaluation of mutant exon-11in c-kit in a recurrent MCT case using CD117immunocytofluorescence,FACS-cell sorting,and PCR[J].Case Report Vet Med,2013,2013: 1-4.

[18] Zemke D,Yamini B,Yuzbasiyan-Gurkan V.Mutations in the juxta membrane domain of c-KIT are associated with higher grade mast cell tumors in dogs[J].Vet Pathol,2002:529-535.

[19] Downing S,Chien M B,Kass P H,et al.Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11and 12of c-kit in mast cell tumors of dogs[J].Am J Vet Res,2002,63(12): 1718-1723.

[20] Passantino L,Passantino G,Cianciotta A,et al.Expression of proto-oncogene C-Kit and correlation with morphological evaluations in canine cutaneous mast cell tumors[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2008,30(3): 609-621.

[21] Schlieben P,Meyer A,Weise C,et al.Tandem duplication of KIT exon 11influences the proteome of canine mast cell tumors[J].J Compa Pathol,2013,148(4): 318-322.

[22] Webster J D,Yuzbasiyan-Gurkan V,Kaneene J B,et al.The role of c-KIT in tumorigenesis: ealuation in canine cutaneous mast cell tumors[J].Neoplasia,2006,8(2): 104-111.

Progress on Diagnosis of Canine Mast Cell Tumors

LI Ge-bin,YANG Zi-yan,XIA Zhao-fei

(CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

Mast cell tumors (MCT) represent the most common cutaneous tumors in the dogs and their metastatic and mortality rate are high.Therefore,it is necessary to have better understanding of novel,effective and therapeutic strategies for control of MCT.The present study introduced two classic pathology grade systems of MCT.One is Patnaik system,the other is kiupel System.Meanwhile,this study described the physiological function and diagnostic value of c-kit gene and the protocol of checking a mutation in the c-kit gene.This study highlighted the relationship between c-kit gene mutation and diagnosis,pathology grading,treatment and prognosis in MCT dogs.

canine; mast cell tumor; diagnosis

2015-06-10

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(2015QC011)

李格賓(1985-)，女，北京人，講師，博士，主要從事小動物腫瘤學(xué)研究。△同等貢獻作者 *通訊作者

S854.4

A

1007-5038(2016)01-0106-04