姚 凱，張 偉，楊琳燕，李 存

(天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

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免疫親和色譜與固相微萃取聯(lián)用技術(shù)研究進展

姚 凱，張 偉，楊琳燕，李 存*

(天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

固相微萃取(SMPE)技術(shù)是近年來快速發(fā)展的一項樣品前處理技術(shù)，具有操作簡便、經(jīng)濟、快速等優(yōu)點。SMPE裝置由手柄和萃取頭兩部分組成，萃取頭上的涂層是最核心的部分，萃取原理是涂層與目標(biāo)組分之間的吸附作用。由于涂層的種類有限和選擇性差，使其不適合萃取復(fù)雜的基質(zhì)。免疫親和色譜(IAC)具有很強的特異性。將兩項技術(shù)聯(lián)用(IAC-SPME)，抗體或者抗體相關(guān)材料作為SMPE的涂層，既有SMPE的優(yōu)點，又彌補了SMPE在選擇性方面的不足，用于直接從復(fù)雜基質(zhì)中萃取分析物，IAC-SPME具有很好的應(yīng)用前景，是目前研究的熱點。論文就IAC-SPME聯(lián)用技術(shù)的研究進展進行了綜述。

固相微萃??；免疫親和色譜；免疫親和色譜-固相微萃取

固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)是一項新興的前處理技術(shù)，最大的優(yōu)點是簡化了前處理過程、降低了溶劑的用量。目前SPME使用的商品化涂層在萃取復(fù)雜基質(zhì)中分析物時存在選擇性差和萃取時間長等問題。免疫親和色譜(immunoaffinity chromatography,IAC)是以抗體、抗原特異性的分子識別為基礎(chǔ)的色譜技術(shù)，擁有很強的特異性和選擇性。利用特異性抗體作為SPME的萃取涂層，可以很好的彌補SPME選擇性的不足，使其更適合于復(fù)雜基質(zhì)中痕量分析物的萃取，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文就SPME與IAC的基本原理以及近年來二者聯(lián)用的研究進展進行綜述。

1 固相微萃取

SPME是一種簡單高效的樣品前處理技術(shù)，此項技術(shù)集萃取、濃縮、解吸、進樣于一體[1]。被廣泛地應(yīng)用于食品[2-3]、農(nóng)業(yè)[4-5]、環(huán)境[6-7]、生物樣品[8-9]、臨床[10]等領(lǐng)域中的藥物殘留分析。SPME在繼承了固相萃取容易操作和凈化效果好等優(yōu)點[11]的同時，又克服了SPE樣品用量大、有機溶劑用量大[12]以及萃取時間長等缺點。

SPME由手柄和萃取頭兩部分組成，萃取頭上的涂層是SPME裝置最核心的部分，萃取原理是涂層與目標(biāo)組分之間的“相似相溶”，極性強的化合物用極性涂層萃取時的效率較高，極性較弱的化合物或非極性化合物用非極性涂層萃取的效果較好。萃取的選擇性、靈敏度和萃取容量都是由涂層種類和厚度決定的，目前商品化的SPME涂層種類有限，多數(shù)商品化涂層是通過物理方法涂覆在萃取頭表面[13]，存在選擇性差、不耐高溫、對有機溶劑不耐受和使用壽命短等缺點，所以制備更高效、更穩(wěn)定、選擇性更強的SMPE涂層已經(jīng)迫在眉睫。

2 免疫親和色譜

IAC是一種利用抗體與抗原性物質(zhì)特異性可逆結(jié)合，實現(xiàn)樣本的分離和分析的一項技術(shù)[14]。基本過程是將抗體共價結(jié)合在惰性基質(zhì)上制成免疫吸附劑，裝柱，用待測組分溶液流經(jīng)IAC柱，待測組分與抗體特異性結(jié)合，雜質(zhì)則沿柱流下，用適宜的洗脫緩沖液洗脫抗原，得到分離、凈化和濃縮后的樣品，通過合適的處理與保存，IAC柱可再生使用。目前IAC在農(nóng)作物檢測[15]、獸藥殘留檢測[16]、環(huán)境樣品檢測[17]等多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。IAC具有選擇性好、純化效果好以及可再生利用等優(yōu)點，使其特別適合作為SPME的涂層。

3 免疫親和色譜與固相微萃取聯(lián)用

免疫親和-固相微萃取(IAC-SPME)使用IAC中的抗體作為SPME的萃取頭涂層，既保留了SPME萃取高效和環(huán)境友好的優(yōu)點，又使其擁有IAC強大的識別能力，尤其是適合于復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量目標(biāo)物的萃取。以下從裝置形式和制備方法等方面對IAC-SPME聯(lián)用進行論述。

3.1 免疫親和-管內(nèi)固相微萃取

免疫親和-管內(nèi)固相微萃取(IAC in-tube SPME)是在毛細管內(nèi)壁涂覆IAC固定相，通過將樣品溶液在毛細管中反復(fù)的吸入/流出，使樣品中的目標(biāo)組分萃取富集到固定相中，毛細管可與高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)或液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)系統(tǒng)相連接，進行分離與檢測。

目前報道的IAC in-tube SPME裝置制備方法主要為硅烷交聯(lián)法。此方法用硅烷化試劑將凈化后的毛細管或者纖維硅烷化，與含戊二醛的PBS溶液反應(yīng)，石英纖維表面被活化后，與抗體溶液反應(yīng)，抗體通過偶聯(lián)作用緊緊結(jié)合在活化表面上?？贵w是通過共價鍵作用結(jié)合在活化表面，因此結(jié)合更加緊密，使用壽命也更長。

Maria E Q等[18]建立了IAC in-tube SPME/LC-MS測定血漿樣品中氟西汀的方法。先將毛細管內(nèi)壁用食人魚溶液處理后，3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTES)進行硅烷化，戊二醛PBS溶液活化，氟西汀抗體偶聯(lián)到毛細管內(nèi)壁制備出免疫親和毛細管。用該毛細管柱萃取血清樣品中的氟西汀，解吸所用的流動相為10mL/L冰醋酸乙腈溶液-20mmol/L醋酸銨水溶液(6∶4，V/V)，高純氮吹干，流動相復(fù)溶，LC-MS進行檢測。這種方法的定量限(limit of quantity,LOQ)為5.00ng/mL，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，在5.00ng/mL～50.00ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.998，此方法所使用的涂層與其他in-tube SPME涂層相比，表現(xiàn)出高靈敏性、高選擇性并具有良好的重現(xiàn)性，已被成功用于臨床病人血清中氟西汀濃度的測定。

除了可以與LC-MS系統(tǒng)連接之外，還可以與HPLC連接使用。Chavesb A R等[19]用IAC in-tube SPME萃取血漿中的α干擾素，熒光檢測器檢測。熔融石英毛細管作為免疫親和柱載體，單克隆抗體作為免疫吸附劑，IAC-熔融石英毛細管的制備參照Maria E Q等[18]方法。對in-tube SPME過程中多項參數(shù)進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的條件為250μL血漿樣品用250μL磷酸緩沖液(25mmol/L,pH 6.0)稀釋，萃取進行20個流入/排出循環(huán)，流速為315μL/min，流動相流經(jīng)毛細管柱進行動態(tài)解吸，解吸所需溶劑體積為50μL。試驗結(jié)果表明，12次萃取之后，由于免疫吸附劑有損失，IAC-in-tube SPME毛細管的萃取效率也因此降低5%。方法的日間變異系數(shù)低于6.2%，在0.006MIU/mL～3.0MIU/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998，LOQ為0.006MIU/mL，此方法性能明顯優(yōu)于非IAC in-tube SPME。

3.2 免疫親和-攪拌棒吸附微萃取

免疫親和-攪拌棒吸附微萃取(immunoaffinity stir bar sorptive microextraction,IAC-SBSME)裝置主要為玻璃棒或者狀似一支色譜注射器，萃取頭是一根涂有IAC的熔融石英纖維或不銹鋼絲，為保護萃取頭，外套細的不銹鋼針管，纖維頭可以在針管內(nèi)伸縮。免疫親和萃取頭的制備方法與IAC in-tube SPME相似，采用硅烷交聯(lián)法。萃取過程為直接將萃取頭浸入樣品溶液，在30℃～100℃下，持續(xù)攪動15min～60min，然后進行洗脫。

Yuan H D等[20]報道了IAC-SBSME法，用于生物樣品中茶堿的分析，將茶堿抗血清作為抗體，APTES和戊二醛進行處理后，共價地固定在熔融的二氧化硅纖維萃取頭上。萃取頭浸入茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液中室溫下用搖床晃動萃取3h，體積為500μL的甲醇-水-三氟乙酸(70∶29∶1，V/V/V)進行解吸。此試驗對萃取頭和免疫親和萃取的重現(xiàn)性進行了研究，結(jié)果顯示用同一萃取頭進行5次分析的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%，當(dāng)茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.1ng/mL～5ng/mL時，抗原-抗體結(jié)合未達到飽和，結(jié)合等溫線的相關(guān)系數(shù)為0.968。最后，在血清樣品中添加10ng/mL和50ng/mL茶堿，經(jīng)上述前處理過程后，使用結(jié)合等溫線成功地對茶堿進行分析，結(jié)果顯示IAC作為SPME涂層在萃取復(fù)雜基質(zhì)中的藥物時，萃取效率與測定結(jié)果并不會受到影響，與普通的SPME方法相比更具特異性。

Lord H L等[21]將苯二氮類藥物的特異性抗體固定到玻璃棒的表面，第1次制備出用于7-氨基氟硝西泮分析的SPME攪拌棒，建立了IAC-SBSME分離尿液中7-氨基氟硝西泮的方法。參照Yuan H D等[20]提出的方法將抗體固定在攪拌棒上。將攪拌棒放置到樣品中萃取30min，500μL甲醇溶液解吸，干燥后，用小體積的流動相復(fù)溶后用HPLC-MS/MS來分析。IAC-SBSME在實際檢測尿液中7-氨基氟硝西泮時，方法的檢測限(limit of detection,LOD)為0.02ng/mL，精密度為1%～27%，定量下限和定量上限之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2%～10%，方法的線性范圍為0.02ng/mL～0.5ng/mL，0.5ng/mL已經(jīng)接近攪拌棒的柱容量，因此線性范圍最大為0.5ng/mL。此方法雖然與其他文獻中報道的檢測7-氨基氟硝西泮的方法有著近似的檢測限，但它的優(yōu)勢在于樣品前處理過程更加簡單，無論是專業(yè)人員或是非專業(yè)人員，均可操作。

Lord H L等[22]對Yuan H D[20]的方法進行了改進，將多克隆抗體進行純化并優(yōu)化了抗體固定過程，方法LOD為0.001ng/mL～0.015ng/mL，線性范圍為0.2ng/mL～2ng/mL，顯著降低了苯二氮類藥物免疫親和探針的檢出限，并擴大了此方法的適用的線性范圍。

Lord H L等[21]成功地證明了IAC-SPME攪拌棒在檢測痕量苯二氮藥物時的實用性，重點主要放在裝置的研發(fā)上。Saharnaz S S[23]也進行了研究，主要目的是當(dāng)把IAC-SPME攪拌棒作為一種廣泛使用的工具測定血漿中的藥物時，采用來自不同公司、不同物種的抗體作為涂層，攪拌棒性能如何。該研究具有很大的實用價值，因為血漿是制藥和毒理學(xué)研究過程中最常用的生物樣品，研究發(fā)現(xiàn)多家公司提供的抗體對3種苯二氮卓藥物(安定、去甲安定、去甲羥基安定)的親和性、容量和交叉反應(yīng)性都很相似，證明了IAC-SPME是一項從復(fù)雜基質(zhì)樣品中萃取小分子很有效的技術(shù)。

3.3 免疫磁性微球

免疫磁性微球(immunomagnetic beads,IMB)技術(shù)是免疫學(xué)和磁載體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展起來的一項新技術(shù)，具有操作簡單、靈敏度高、省時等特點[24]。分離原理是將抗體結(jié)合到磁性微球上，得到免疫磁性微球，將其與抗原特異性結(jié)合，在外加磁場的作用下，抗原和微球的復(fù)合物發(fā)生移動，因與其他組分磁反應(yīng)性不同，故能達到分離抗原的目的。

IMB的制備通常分為兩步：首先將制成磁性微球，然后將活性基團引入微球表面，載體表面和抗體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)合到載體上，形成IMB。

IMB由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。因此載體微球是制備免疫磁性微球最關(guān)鍵的部分，其制備方法主要包括聚合物組合法和單體聚合法。聚合物組合法制備過程簡單，但磁性微球大小、粒度、形狀均不好控制，而且容易混有雜質(zhì)，給免疫測定和細胞分離帶來了很大困難[25]。

單體聚合法是用引發(fā)劑將溶液中單體聚合在磁性微球表面，主要方法有懸浮聚合、分散聚合和乳液聚合(包括乳液聚合、種子聚合)等。得到的磁性微球粒度均勻、形狀規(guī)則，但微球表面需要經(jīng)過化學(xué)修飾才含有活性功能基團。

Lund H等[26]建立了IMB/LC-MS選擇反應(yīng)檢測人血清和尿液中絨毛膜促性腺激素(HCG)的方法，并應(yīng)用到懷孕的臨床診斷中。IBM制備過程如下：1g 磁珠中加入20mg HCG單克隆抗體，1mg磁性微球約含有15μg抗體。抗體在與微球結(jié)合之前于酸性條件下(HCl調(diào)節(jié)至pH 2.5)0℃孵育1h，用PBS緩沖液稀釋至10mg微球/mL。微量離心管中加入500μL含50mg/L 吐溫-20的PBS緩沖液，再加入20μL覆有單克隆抗體的磁性微球，用振蕩器振蕩后快速離心，棄上清，離心管中加入1mL樣品(血漿或尿液)振蕩混勻1h促進微球上的抗體與抗原結(jié)合，將離心管放置在磁道上收集磁性微球，洗脫液洗脫磁性微球，將洗脫液用氮氣吹干，復(fù)溶后用LC-MS進行分析。結(jié)果表明，該方法在血漿和尿液中的檢測限分別為5IU/L和2IU/L，定量下限分別為10IU/L和5IU/L，血漿中的相關(guān)系數(shù)大于0.997，尿中的相關(guān)系數(shù)大于0.999。

Rafalko A等[27]為了提高分析物純度并減少干擾，將蛋白免疫富集到磁性微球上，LC-MS/MS多反應(yīng)檢測腎癌細胞系中的碳酸酐酶12。將覆有IgG的磁性微球用檸檬酸磷酸緩沖液(pH 5.0)沖洗2次，使用3倍微球體積的含抗碳酸酐酶12多克隆抗體的PBS緩沖液將微球懸浮，室溫下將溶液振蕩1h，將上清液廢棄，磁性微球用0.5mL檸檬酸磷酸緩沖液沖洗2次，0.5mL的PBS緩沖液沖洗3次除去未結(jié)合的蛋白，用1倍微球體積的PBS緩沖液將微球重新懸浮。制備好的IMB與腎癌細胞的消解液混合，萃取后用LC-MS/MS檢測，結(jié)果表明此方法可以對細胞消解液中低至152fmol的碳酸酐酶12進行定量，檢測限低至fmol(1fmol=10-15mol)水平，日內(nèi)RSD≤17%，日間RSD為7.0%～14%。

4 結(jié)語

IAC具有很強的選擇特異性，SPME具有環(huán)境友好、操作簡單和經(jīng)濟等優(yōu)點。兩者聯(lián)用的技術(shù)雖然還沒有得到廣泛的應(yīng)用，但是抗體作為SPME涂層表現(xiàn)出的優(yōu)越性已經(jīng)被人們所認可。IAC、SPME和IAC-SPME聯(lián)用的優(yōu)缺點對比，IAC優(yōu)點：①選擇性、特異性強；②凈化、富集效果好；③可重復(fù)使用。其缺點：①價格昂貴；②對酸堿條件耐受性弱；③需針對目標(biāo)分析物制備特異性抗體。SPME優(yōu)點：①操作簡單、耗時少；②所需樣品量少；③無需溶劑，對環(huán)境友好。SPME缺點：萃取頭涂層選擇性差，無法有效萃取復(fù)雜基質(zhì)中的痕量分析物。IAC-SPME在兼具IAC和SPME的優(yōu)點的同時，也存在其缺點：①裝置形式種類有限；②SPME萃取頭上偶聯(lián)面積小，偶聯(lián)的抗體量少；③未得到廣泛應(yīng)用。

IAC-SPME可與檢測系統(tǒng)聯(lián)合使用，適用范圍很廣，擁有極強的富集和凈化能力，在復(fù)雜基質(zhì)中進行目標(biāo)物萃取時有著獨特的優(yōu)勢；與傳統(tǒng)IAC相比，抗體使用量少，經(jīng)濟節(jié)約。但同時存在著一些不足，如抗體固定的方法單一、較難獲得性質(zhì)均一的抗體和柱容量低等，目前報道的IAC-SPME文獻多采用硅烷交聯(lián)法，有待于進一步研究其他的固定方法，所需的均質(zhì)性抗體隨著商品化單克隆抗體的大量生產(chǎn)得到解決。此外，IAC-SPME尚處于探索階段，報道的裝置形式種類有限，發(fā)展更多種類簡單而且易于操作的萃取裝置形式是以后的發(fā)展趨勢。目前關(guān)于IAC In-Tube SPME和IAC-SBSME應(yīng)用的報道均局限于人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，未來，IAC-SPME聯(lián)用技術(shù)在農(nóng)業(yè)、食品安全、環(huán)境等多領(lǐng)域也會得到研究者的關(guān)注，隨著技術(shù)的不斷完善，會逐漸由實驗室走向商品化生產(chǎn)。此項技術(shù)也有直接與質(zhì)譜檢測技術(shù)結(jié)合進快速分析的趨勢。

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Progress on Combination of Immunoaffinity Chromatography and Solid Phase Microextraction

YAO Kai,ZHANG Wei,YANG Lin-yan,LI Cun

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin,300384)

Solid phase microextraction (SPME) is a simple,convenient,economic and fast sample preparation method.Extraction device consists of a holder and fiber,coating is the core of device.The extraction of some complex matrices can be difficult owing to poor range of available coatings and lack of selectivity.Immunoaffinity chromatography(IAC) has a high degree of inherent selectivity,it is combined with SPME by immobilization of the antibody on a fused silica fiber,the resultant IAC-SPME fiber is more convenient to use and is highly selective,permitting the direct extraction of analytes from many complicated matrices.IAC-SPME will become a trend in the development of many aspects.This article introduced the combination of IAC and SPME.

solid phase microextraction;immunoaffinity chromatography; IAC-SPME

2015-07-31

國家自然科學(xué)基金項目(31372482)

姚 凱(1991-)，男，內(nèi)蒙古卓資人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。*通訊作者

S854.4

A

1007-5038(2016)01-0088-05