陳偉貞，余輝亮，李 悅，賴金倫，周飛燕，韓 麗，胡長敏，李 翔，熊家軍，丁明星，陳建國*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢 430070；2.湖北神農(nóng)架國家級自然保護區(qū)管理局 442421；3.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430070；4.華中農(nóng)業(yè)大學遺傳育種教育部重點實驗室，湖北武漢 430070)

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一例神農(nóng)架金絲猴頭部膿腫的診斷

陳偉貞1，余輝亮2，李 悅3，賴金倫1，周飛燕1，韓 麗1，胡長敏1，李 翔4，熊家軍4，丁明星1，陳建國1*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖北武漢 430070；2.湖北神農(nóng)架國家級自然保護區(qū)管理局 442421；3.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢 430070；4.華中農(nóng)業(yè)大學遺傳育種教育部重點實驗室，湖北武漢 430070)

神農(nóng)架金絲猴為我國一級保護動物，做好金絲猴疾病的預防與治療工作非常重要。論文針對一例神農(nóng)架籠養(yǎng)金絲猴由于頭部膿腫引起死亡的病例開展研究。首先對病變組織進行石蠟切片和HE染色，然后對膿液進行細菌分離鑒定，并對分離純化的菌株進行藥敏試驗。結果顯示,病變組織為增生的組織，此膿腫是由金黃色葡萄球菌感染而引起的，所分離的金黃色葡萄球菌對恩諾沙星、阿奇霉素、復方新諾明、優(yōu)孢欣、左氧氟沙星、氨芐西林、頭孢唑林、氯霉素、氧氟沙星、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星均敏感，對青霉素、林可霉素耐藥。此結果可以為金絲猴疾病的預防與治療提供參考。

金絲猴；膿腫；診斷；金黃色葡萄球菌

川金絲猴是我國特有的珍貴物種，數(shù)量稀少，總數(shù)量約為1.5萬只[1]，為國家一級保護動物。川金絲猴主要分布于四川、甘肅、陜西和湖北地區(qū)，共有3個亞種[2]，以家庭為單位群居生活，主要集中在海拔1500m ～3500m的針闊混交林和針葉林內(nèi)，為樹棲生活，喜跳躍。神農(nóng)架金絲猴為川金絲猴的一個獨立亞種，分布在湖北省神農(nóng)架林區(qū)，在川金絲猴分布的最東端，分為3個大群體，8個小種群，僅有1282只。其中籠養(yǎng)金絲猴有4個家庭15只。

金絲猴臨床疾病的報道，有對中暑[3]、消化道類疾病[4]、腹壁透創(chuàng)[5]等疾病的治療，川金絲猴感染方面的報道主要有多殺性巴氏桿菌[6]、寄生蟲[7]等感染。目前為止還未見到關于金絲猴頭部膿腫的有關報道。本研究針對神農(nóng)架繁育中心的1只金絲猴因頭部膿腫而死亡的病例進行了系統(tǒng)研究，對病變組織進行組織切片和HE染色，觀察組織病理學變化，然后對引起膿腫的病原菌進行細菌的分離鑒定和藥敏試驗，從而探討引起此次金絲猴發(fā)病的主要病因，為今后更好的保護金絲猴提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 神農(nóng)架人工繁育中心的1只雄性金絲猴，7周歲，體重為15kg。

發(fā)病情況：2014年10月該金絲猴左側額部腫脹，1周之后破潰，有膿液流出，工作人員為排膿，用生理鹽水清理。之后，破潰面積越來越大，無愈合現(xiàn)象，腫塊的體積變大，并且蔓延至左側臉頰，致使嘴巴不能張開，不能進食,進行手術。手術前發(fā)現(xiàn)該猴精神沉郁，頭部左側額頭上方有一直徑約8cm大的膿腫(圖1)，體溫36.5℃，麻醉輸液強心進行排膿手術，但術后不幸多器官衰竭死亡。

圖1 頭部膿腫
Fig.1 Head abscess

1.1.2 主要材料與試劑 Leica RM2016切片機為萊卡公司產(chǎn)品；藥敏試紙片為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為美國OMEGA公司產(chǎn)品；引物由武漢擎科生物公司合成；測序在武漢擎科生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制作 金絲猴死亡后，用手術刀切開膿腫，觀察到里面有大量的增生組織，切取2cm～3cm長寬的組織，立即放入100mL/L的福爾馬林中固定，然后帶回實驗室。按常規(guī)程序制作石蠟切片，并對切片進HE染色。

1.2.2 病原菌的分離與鑒定 膿腫部位的病變組織收集到無菌的離心管中，帶回實驗室，將組織涂于固體培養(yǎng)基(TSA)上進行細菌培養(yǎng)。將培養(yǎng)出的菌落挑取出來，繼而用TSA進行純化，并且用伊紅美藍和Baird-Parker培養(yǎng)基進行鑒定。

1.2.3 16S rDNA的PCR擴增和測序鑒定 Baird-Parker培養(yǎng)基上有菌落生長，懷疑為金黃色葡萄球菌，挑取此菌落，參照文獻[8]，用DNA提取試劑盒提取菌落的DNA，選取金黃色葡萄球菌的特異性耐熱核酸酶nuc基因序列，應用Primer5.0軟件設計1對引物序列為：nucF：5′-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC-3′；nucR：5′-AAAGGGC- AATACGCAAAGAGGT-3′。PCR擴增體系為25μL：Premix 12.5μL，P1/P2各2μL，DNA模板2μL，超純水6.5μL。反應條件如下：94℃ 5min;94℃ 60s，50℃ 30s，72℃ 60s，30個循環(huán);然后72℃ 10min。反應產(chǎn)物用12g/L凝膠電泳檢測。并將陽性擴增產(chǎn)物送至武漢擎科生物公司測序。

1.2.4 藥敏試驗 采用紙片法對分離出的細菌進行藥敏試驗，選用的藥物分別是青霉素、林可霉素、恩諾沙星、阿奇霉素、鏈霉素、卡那霉素、復方新諾明、優(yōu)孢欣、左氧氟沙星、氨芐西林、頭孢唑啉、氯霉素、氧氟沙星、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星。

2 結果

2.1 組織切片HE染色

由HE染色的結果(圖2和圖3)可知，染色之后的細胞可看到組織呈絮狀，空泡現(xiàn)象明顯，未見完整有序的細胞形態(tài)，可看到細胞核，但是未見到核分葉現(xiàn)象，有大量的血細胞。說明此組織為增生的組織，未有癌變發(fā)生。

2.2 病原菌的分離與鑒定

TSA和Baird-Parker培養(yǎng)基中均長出菌落，TSA中長出2mm～3mm的白色濕潤菌落(圖4)，Baird-Parker菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色菌株，邊緣為淡色，周圍有渾濁帶外層有透明圈的菌落(圖5)。伊紅美藍培養(yǎng)基上無生長菌落。初步判定此菌落為金黃色葡萄球菌。

圖2 HE染色的組織切片
Fig.2 Tissue section of HE staining

圖3 HE染色的組織切片
Fig.3 Tissue section of HE staining

圖4 TSA培養(yǎng)基上分離的菌落
Fig.4 The bacterial colony on TSA medium

圖5 Baird-Parker培養(yǎng)基上分離的菌落
Fig.5 The bacterial colony on Baird-Parker medium

2.3 16S rDNA的PCR結果和序列測定

提取疑似金黃色葡萄球菌的菌落的DNA，然后用特異性引物進行PCR擴增，擴增之后用12g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳。由圖6可知菌落均能夠擴增出484bp的產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物測序，將測序結果放于GenBank中比對，符合度為99%,證明該菌落是金黃色葡萄球菌。

M.DNA標準DL 2000；1～4.PCR產(chǎn)物；5.陰性對照
M.DNA Marker DL 2000; 1-4.PCR products; 5.Negative control

圖6 金黃色葡萄球菌nuc基因PCR擴增結果
Fig.6 PCR amplification of nuc gene ofStaphyloccocusaureus

2.4 藥敏試驗結果

依據(jù)表1藥敏試驗的結果可知，所分離的金黃色葡萄球菌對恩諾沙星、阿奇霉素、復方新諾明、優(yōu)孢欣、左氧氟沙星、氨芐西林、頭孢唑林、氯霉素、氧氟沙星、頭孢哌酮、環(huán)丙沙星均敏感，而對青霉素、林可霉素耐藥。

表1 分離鑒定的金黃色葡萄球菌對15種藥物的耐藥性Table 1 Drug resistance of Staphylococcus aureus to 15antimicrobial agents

3 討論

由于金絲猴的數(shù)量稀少，并且其繁殖率低，每減少一只對我們國家來講都是一個很大的損失，所以做好金絲猴疾病的預防、診斷與治療工作非常重要。

試驗結果表明，該金絲猴的死亡主要是由金黃色葡萄球菌感染引起的頭部膿腫，膿腫蔓延至臉部，從而致使此個體不能進食，身體極度消瘦，最終導致其死亡。

金黃色葡萄球菌是人和動物的一種重要的病原菌，侵襲力強，產(chǎn)生的毒素、酶種類多，毒力強，既可引起局部化膿感染，比如奶山羊的乳房炎[9]、人的角膜炎[10]等，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等嚴重感染[11]，并且其預防比較困難[12]。人和動物的帶菌率較高，主要寄生在人體的皮膚、頭發(fā)、咽喉、鼻腔等，易經(jīng)手污染食品[13]。本試驗中的金絲猴生活在神農(nóng)架自然保護區(qū)的繁殖中心，平時較少與外界人員接觸，每天由飼養(yǎng)員按時飼喂，所以此金絲猴的感染可能是由于飼養(yǎng)員在準備、飼喂食物的過程中把自身攜帶的細菌傳染給金絲猴。

王登峰等[14]對我國牛源的金葡菌的耐藥性進行研究結果表明金葡菌對抗生素的耐藥現(xiàn)象嚴重，且多呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。王鳳等[15]從奶牛乳房炎中分離的金葡菌對青霉素和氨芐西林的耐藥率高達81.25%以上。巢國祥等[13]對食源性的金葡菌耐藥性進行分析，發(fā)現(xiàn)其對青霉素、四環(huán)素、凝固酶陰性、苯唑西林耐藥率分別高達93.10%、49.43%、37.93%和79.31%,且多呈現(xiàn)2種以上混合的耐藥性。該藥敏試驗結果可知，此金黃色葡萄球菌對青霉素和林可霉素耐藥，對恩諾沙星、優(yōu)孢欣、頭孢唑林、氯霉素、氧氟沙星等均敏感，這與其他動物源的金黃色葡萄球菌的耐藥性相比較，此試驗中分離的金黃色葡萄球菌耐藥性比較低，分析其原因，由于金絲猴為野生動物，不經(jīng)常使用抗生素，故不易產(chǎn)生耐藥性。對青霉素、林可霉素耐藥，可能是游客投遞食物造成的。這種現(xiàn)象在其他野生動物的研究中也有發(fā)現(xiàn)，比如權自芳等[16]生活于旅游景區(qū)內(nèi)的赤腹松鼠腸道細菌分離鑒定結果表明金黃色葡萄球菌的檢出率較高為84.85%，但是此菌僅對大觀霉素耐藥。

做好金絲猴的預防與治療工作非常重要，鑒于本研究的檢測結果，建議飼養(yǎng)員以后在給金絲猴準備食物的過程中一定要帶手套，食物盡量用新鮮的、干凈的飼喂，不可飼喂霉爛的食物。在發(fā)生疾病的時候，可使用恩氟沙星、氧氟沙星等喹諾酮類藥物對其進行治療。嚴禁游客投遞食物。

[1] Chang Z F,Liu Z J,Yang J Y,et al.Noninvasive genetic assessment of the population trend and sex ratio of the Shennongjia population of Sichuan snub-nosed monkeys (Rhinopithecusroxellana)[J].Chinese Sci Bul,2012,57(10):1135-1141.

[2] Huang Z P,Qi X G,Garber P A,et al.The use of camera traps to identify the set of scavengers preying on the carcass of a golden snub-nosed monkey (Rhinopithecusroxellana)[J].PLoS One,2014,9(2):e87318.

[3] 王宇翔,陳小麗,陳 霖,等.川金絲猴中暑的診療[J].福建畜牧獸醫(yī),2015(2):52-54.

[4] 壽曉玲,王才益,杜愛芳.杭州動物園川金絲猴消化道疾病的防控研究[J].浙江畜牧獸醫(yī),2014,39(3):41-42.

[5] 劉文旺.金絲猴腹壁透創(chuàng)一例的治療[J].動物醫(yī)學進展,2009,30(6):127-128.

[6] 劉建國,徐澤年,賈 博,等.一例病死金絲猴的病原分離鑒定與病理形態(tài)學觀察[J].動物醫(yī)學進展,2008,29(3):113-115.

[7] 李 梅,楊光友.我國金絲猴寄生蟲種類及其疾病研究概況[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(6):155-158.

[8] 劉 洋.我國動物源金黃色葡萄球菌的耐藥性和分型研究[D].江蘇揚州:揚州大學獸醫(yī)學院,2012.

[9] 姚運亮,田婷婷,許君艷,等.關中奶山羊隱性乳房炎病原菌的分離鑒定[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(4):116-119.

[10] Boto-de-los-Bueis A,del Hierro Zarzuelo A,García P A,et al.Staphylococcusaureusblepharitis associated with multiple corneal stromal microabscess,stromal edema,and uveitis[J].Ocular Immunol Inflam,2015,23(2):180-183.

[11] 郭萬柱,吳 彤,陳瑤先.動物微生物學[M].四川成都:四川科技出版社,1997：215-219.

[12] Jansen K U,Girgenti D Q,Scully I L,et al.Vaccine review: "Staphyloccocusaureusvaccines: problems and prospects"[J].Vaccine,2013,31(25): 2723-2730.

[13] 巢國祥,焦新安,周麗萍,等.食源性金黃色葡萄球菌流行特征、產(chǎn)腸毒素特性及耐藥性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(8):904-907.

[14] 王登峰,李建軍,段新華,等.我國牛源金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀及藥敏檢測方法探討[J].中國動物傳染病學報,2011,19(1):31-38.

[15] 王 鳳,宋 立,湯德元,等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定、血清型及耐藥性研究[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(6):62-67.

[16] 權自芳,劉 丹,楊紹林,等.赤腹松鼠腸道細菌分離鑒定及耐藥性分析[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(1):125-129.

Diagnosis for a Case Head Abscess of Shennongjia Golden Monkey

CHEN Wei-zhen1,YU Hui-liang2,LI Yue3,LAI Jin-lun1,ZHOU Fei-yan1,HAN Li1,HU Chang-min1,LI Xiang4,XIONG Jia-jun4,DING Ming-xing1,CHEN Jian-guo1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070，China; 2.ManagementBureauofShennongjiaNationalNatureReserve,Wuhan,Hubei,442421，China; 3.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070，China; 4.KeyLaboratoryofAnimalBreedingandReproduction,MinistryofEducation,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

Shengnongjiao golden monkey is the first class of protected animal,the prevention and treatment of diseases in this species are very important.This research studied a dead captive gold monkey with head abscess.The paraffin sections of pathological tissue were stained with HE.The bacteria in pus were isolated and identified.The isolated and purified stain was used to do the drug sensitivity test.The results showed that the pathological tissue was hyperplasia tissue,and the abscess was caused by the infection ofStaphylococcusaureus.The results of drug sensitivity showed thatStaphylococcusaureuswas sensitive to enrofloxacin,azithromycin,sulfamethoxydiazine,ubrolexin,levofloxacin,ampicillin,cefazolin,chloramphenicol,ofloxacin,cefoperazone and ciprofloxacin,and was resistant to penicillin and lincomycin.This results can provide help for the prevention and treatment of the disease in golden monkey.

golden monkey; abscess; diagnosis;Staphylococcusaureus

2015-07-02

國家支撐計劃項目(2013BAD03B01)

陳偉貞(1989-),女,河南洛陽人,碩士,主要從事臨床獸醫(yī)學研究。*通訊作者

S865.31

B

1007-5038(2016)01-0133-04