喬明明，孫 明，馮向輝，王 靜，王傳彬，才學鵬，陳西釗,*

(1.北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京 100085；2.中國動物疫病預防控制中心，北京 100125)

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禽流感病毒N9亞型RT-PCR檢測方法的建立

喬明明1，孫 明1，馮向輝1，王 靜1，王傳彬2，才學鵬2，陳西釗1,2*

(1.北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京 100085；2.中國動物疫病預防控制中心，北京 100125)

為建立一種簡便、快速、靈敏、準確的禽流感病毒N9亞型檢測方法，根據GenBank中收錄的禽流感病毒N9亞型高度保守的基因序列設計引物，通過優(yōu)化反應條件建立禽流感病毒N9亞型RT-PCR檢測方法,并對該方法進行靈敏度、敏感性、特異性試驗和臨床樣品檢測。建立了禽流感病毒N9亞型RT-PCR檢測方法，用該方法檢測時，H7N9、H10N9均呈陽性，而非N9亞型的禽流感病毒及新城疫病毒等其他禽傳染病病毒均呈陰性，能檢測到1/32血凝單位的H7N9禽流感病毒。 建立了禽流感病毒N9亞型RT-PCR檢測方法，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強的特點，值得推廣應用。

禽流感病毒；N9亞型；RT-PCR

禽流感病毒(Avian influenza virus ，AIV)為單股負鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科、A型流感病毒屬，具有抗原多樣性和高度變異性。根據表面血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的不同AIV可分為17個H亞型和10個N亞型。AIV主要感染禽類，個別亞型可感染人類、豬、馬等哺乳動物。H7N9禽流感病毒是AIV的一個亞型，原屬于低致病性病毒，僅在禽間發(fā)現；2013年3月下旬，上海、安徽兩地出現嚴重的呼吸道感染患者[1-3]，后經證實為新型H7N9禽流感病毒感染[4-5]。這種新型流感病毒遺傳背景非常復雜[6]，其HA基因與H7N3具有很高的同源性，NA基因與H4N9、H11N9同源性極高[7-8]，因其對禽類致病力低而對人有很高的致病力和死亡率而增加了該病的防控難度[9]，建立快速、準確的檢測方法成為防控該病的關鍵。中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布了人感染H7N9禽流感的診療方案，將從檢測樣品中分離到禽流感H7N9病毒或禽流感H7N9病毒核酸檢測陽性等作為該病的確診依據[10]。目前對該病的診斷主要是針對H7亞型建立的RT-PCR，還沒有建立檢測禽流感病毒N9亞型的RT-PCR的報道。因此，建立禽流感病毒N9亞型的RT-PCR檢測方法對H7N9禽流感病毒感染的診斷和防控有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準AIV毒株 滅活的標準AIV毒株H1～H15亞型和N1～N9亞型、新城疫病毒(NDV)、雞產蛋下降綜合征病毒(EDS-76)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、馬立克氏病病毒(MDV)、鴨瘟病毒(DEV)弱毒疫苗株、鴨病毒性肝炎弱毒疫苗株，均由中國動物疫病預防控制中心獸醫(yī)診斷室(農業(yè)部獸醫(yī)診斷中心)保存；雞新城疫耐熱保護劑活疫苗(La Sota株)購自乾元浩生物股份有限公司。44份臨床樣品為北京世紀元亨動物防疫技術有限公司研發(fā)部實驗室采集的浙江地區(qū)疑似流感癥狀的鴨子喉氣管組織。

1.1.2 儀器與試劑 RNA提取試劑為Qiagen公司產品產品；AMV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor、GoTaq DNA Polymerase為Promega公司產品；dNTP為北京華美生科生物技術有限公司產品；Trans 2K DNA Marker為北京全式金生物技術有限公司產品；TGRANDIENT PCR儀為HYBAID公司產品；UVI Firereader XS 凝膠成像系統(tǒng)為華粵有限責任公司產品。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測方法的建立及條件優(yōu)化

1.2.1.1 引物設計 參照禽流感病毒N9亞型GenBank中高度保守的NA基因序列，應用DNA Man生物分析軟件進行比對分析，找到保守同時完全區(qū)別于禽流感其他亞型的位點，應用Primer 5.0軟件，針對這個特異性位置設計針對禽流感病毒N9亞型的特異性引物，預期擴增的片段大小為377bp，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列為：

N9上游引物：5′-GCTGGCCACTATCATCACC-3′

N9下游引物：5′-TCGTTCCCCGTAACATGA-3′

1.2.1.2 病毒RNA模板提取 按照Qiagen的RNA提取試劑盒說明書進行RNA提取。

1.2.1.3 RT-PCR擴增 本試驗為反轉錄和PCR同時進行，反應液總體積為25μL組成成分如下：5×buffer 5μL(含MgCl2)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，10μmol/L上游和下游引物1.8μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL) 1μL，AMV反轉錄酶(10U/μL)0.2μL，RNA酶抑制劑(40U/μL)0.3μL，無菌無核酸酶水12.5μL，提取的樣品RNA 2μL。RT-PCR反應條件：42℃ 45min；94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，進行35個循環(huán)；72℃ 7min。

1.2.1.4 RT-PCR擴增體系及程序的條件優(yōu)化 在RT-PCR反應體系中使用不同PCR緩沖液、引物濃度、反轉錄酶濃度及退火溫度，觀察其對檢測結果的影響，確定最佳的PCR緩沖液、引物濃度、反轉錄酶濃度及退火溫度。

1.2.2 檢測方法的靈敏度試驗 禽流感病毒H7N9參考毒株血凝效價為512，將該毒株稀釋成1個血凝效價，再逐倍稀釋至1/32，用建立的禽流感N9檢測方法分別對稀釋的樣品進行檢測，確定該檢測方法的靈敏度。

1.2.3 檢測方法的敏感性試驗 用建立的檢測方法檢測禽流感病毒H7N9、H10N9兩株病毒，分析該方法對禽流感N9亞型不同毒株的敏感性。

1.2.4 檢測方法的特異性試驗 用建立的禽流感病毒N9亞型RT-PCR方法檢測滅活的標準AIV毒株H1～H15亞型和N1～N8亞型、NDV、EDS-76、IBV、IBDV、MDV、鴨瘟弱毒疫苗株、鴨病毒性肝炎弱毒疫苗株，SPF雞胚尿囊液、SPF雞肌肉組織、SPF雞腦組織、SPF雞喉氣管組織、SPF雞喉氣管拭子、SPF雞泄殖腔拭子，分析結果以確定檢測方法的特異性。

1.2.5 臨床樣品檢測 用建立的檢測方法對44份臨床收集的疑似禽流感病毒病料進行檢測，對該方法進行效果驗證。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測方法的條件優(yōu)化

經過反復試驗，選出最佳反應條件為綠色反應緩沖液、引物濃度為0.6μmol/L、反轉錄酶濃度為0.08U、退火溫度為52℃，得出的最佳反應體系為：在25μL反應體系中，5×buffer 5μL(含MgCl2)，2.5mmol/L dNTPs 2.5μL，10μmol/L上游和下游引物1.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL) 1μL，AMV反轉錄酶(10U/μL)0.2μL，RNA酶抑制劑(40U/μL)0.3μL，無菌無核酸酶水12.5μL，最后加入提取的RNA模板2μL。RT-PCR反應條件：42℃ 45min；94℃ 3min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)；72℃ 7min。

2.2 檢測方法的靈敏度

將禽流感H7N9參考毒株稀釋成1個血凝效價，再逐倍稀釋至1/32，用建立的禽流感N9檢測方法分別對稀釋的樣品進行檢測，結果如圖1所示，最低能檢測到1/32個血凝單位的H7N9病毒。

1.陽性對照；2～5.依次為1/2、1/4、1/16、1/32個血凝單位的H7N9；6.陰性對照；7.DNA標準 DL 2000
1.Positive control ;2-5.1/2，1/4，1/16，1/32HAU H7N9successively;6.Negative control;7.DNA Marker DL 2000

圖1 禽流感病毒N9亞型RT-PCR靈敏度
Fig.1 RT-PCR sensitivity of avian influnza virus subtype N9

2.3 檢測方法的敏感性

用建立的禽流感N9亞型檢測方法檢測禽流感病毒H7N9、H10N9兩株病毒，結果兩株病毒均呈陽性，表明該方法可檢測多種N9亞型的禽流感病毒(圖2)。

2.4 檢測方法的特異性

用建立的禽流感病毒N9亞型RT-PCR檢測滅

活的標準AIV毒株H1～H15亞型和N1～N9亞型、NDV、EDS-76、IBV、IBDV、MDV、鴨瘟弱毒疫苗株、鴨病毒性肝炎弱毒疫苗株，SPF雞胚尿囊液、SPF雞肌肉組織、SPF雞腦組織、SPF雞喉氣管組織、SPF雞喉氣管拭子、SPF雞泄殖腔拭子，檢測結果均為陰性，建立的方法具有良好的特異性。

1.DNA 標準DL 2000；2.H7N9；3.H10N9；4.陽性對照；5.陰性對照
1.DNA Marker DL 2000;2.H7N9;3.H10N9;4.Positive control;5.Negative control

圖2 禽流感病毒N9亞型RT-PCR敏感性
Fig.2 RT-PCR sensibility of avian influnza virus subtype N9

2.5 臨床樣品檢測結果

用建立的檢測方法對44份臨床收集的疑似禽流感病毒病料進行檢測，結果檢出5份陽性樣品(圖3)，經測序驗證5份陽性樣品的擴增產物均為禽流感N9亞型的基因片段。

1～22、25～46.臨床樣品； 23、47.陽性對照； 24、48.陰性對照；M.DNA 標準DL 2000
1-22,25-46.Clinical samples; 23,47.Positive control;24,48.Negative control; M.DNA Marker DL 2000

圖3 部分禽流感病毒N9亞型RT-PCR臨床樣品檢測結果
Fig.3 Detection results of avian influnza virus subtype N9in clinical samples by RT-PCR

3 討論

2013年流行的禽流感病毒H7N9亞型病毒，NA蛋白上發(fā)生5個氨基酸的缺失，這樣的缺失可改變病毒的嗜親性，從而影響到病毒的復制能力[11]。新型H7N9病毒所表現出來的人類組織趨向性及引起人類嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病的特征說明，病毒在引起人類大流行的進程中已經發(fā)生了關鍵性的變異[12]，一旦人傳人的傳播途徑得以實現，那么人類將面臨極其嚴重的公共衛(wèi)生問題[13-14]。

目前診斷禽流感N9亞型的常用方法主要為神經氨酸酶抑制試驗，耗時、費力等存在諸多問題，嚴重影響了對這種疾病的有效控制，遠遠不能滿足現代養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。RT-PCR技術可從基因水平檢測到病毒，具有靈敏性高、特異性強、操作簡捷等特點，更適合實驗室的快速檢測與診斷。

本研究建立的禽流感病毒N9亞型的RT-PCR檢測方法，采用柱式提取核酸[15]，反轉錄和PCR擴增一步法檢測，簡便、快捷、減少污染機率。該檢測方法是針對所有的N9亞型的保守區(qū)域設計的引物，可用于N9亞型的分型，與其他亞型沒有交叉。與H7亞型的診斷試劑盒結合使用，可準確地檢測到新型H7N9禽流感病毒。

[1] Gao R,Cao B,Hu Y,et al.Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J].N Engl J Med,2013,368(20):1888-1897.

[2] 朱聞裴，高榮寶，王大燕，等.H7亞型禽流感病毒概述[J].病毒學報，2013，29(3)：245-249.

[3] 孫 陽，沈銀忠，林 萍，等.新型禽流感：H7N9[J].檢驗醫(yī)學，2013，28(9)：739-744.

[4] Lu Jing,Wu Jie,Zeng Xianqiao,et al.Continuing reassortment leads to the genetic diversity of influenza virus H7N9N in Guangdong China[J].J Virol，2014,88(15): 8297-8306.

[5] 秦彥珉，梅樹江，謝 旭，等.深圳市 19例人感染 H7N9禽流感確診病例流行病學分析[J].中國公共衛(wèi)生，2015，31(1)：11-13.

[6] 郭曉蘭，司露露，管大偉，等.兩株人H7N9禽流感病毒的全基因組測序及分子特征分析[J].中山大學學報，2015，36(2):167-175.

[7] 唐國建，李國民，焦夕琴，等.疑似H7N9禽流感病毒感染患者流感病毒通用引物檢測結果分析[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2013，10(24):3359-3360.

[8] 翁育偉，張擁軍，謝劍鋒，等.福建省首例人感染H7N9禽流感病例實驗室診斷和病毒序列分析[J].中國人獸共患病學報，2013(6):543-546.

[9] 陳永雪.基于禽中低致病性的H7N9禽流感模型的動力學性質[J].生物數學學報，2014，29(4)：627-634.

[10] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.人感染H7N9禽流感診療方案(2版) [J].傳染病信息，2013,26(2):65-67.

[11] Kageyama T,Fujisaki S,Takashita E,et al.Genetic analysis of novel avian A (H7N9) influenza viruses isolated from patients in China,February to april 2013[J].Euro Surveill,2013,18(15):20453-20467.

[12] 于玉鳳，郭曉蘭，王 穎，等.H7N9禽流感病毒對人類致病的分子基礎分析[J].中山大學學報:醫(yī)學科學版，2013，34(5):657-655.

[13] Chen Y,Liang W,Yang S,et al.Human infections with the emerging avian influenza A H7N9virus from wet market poultry: clinical analysis and characterisation of viral genome[J].Lancet，2013,381(9981):1916-1925.

[14] 張宏偉.H7N9禽流感的病毒特征及其對人類健康的潛在威脅[J].第二軍醫(yī)大學學報，2013，34(6)：591-594.

[15] 張險朋，董 瑜，溫賢誠，等.三種核酸提取方法檢測禽流感病毒的比較[J].動物醫(yī)學進展，2014，35(11)：116-119.

Development of RT-PCR for Detection of Avian Influnza Virus Subtype N9

QIAO Ming-ming1,SUN Ming1,FENG Xiang-hui1,WANG Jing1,WANG Chuan-bing2,CAI Xue-peng2,CHEN Xi-zhao1,2

(1.BeijingAnhealAnimalAntiepidemicTechniqueLimitedCompany,HaidianDistrict,Beijing,100085,China;2.ChineseCenterforAnimalDiseaseControlandPrevention,ChaoyangDistrict,Beijing,100125,China)

To develop a RT-PCR kit for detection and identification of avian influnza virus subtype N9,a pairs of primes were designed for subtype N9avian influenza virus according to the sequences of high pathogenic avian influnza virus subtype N9in GenBank,after the optimization of reaction condition.The experiments about sensitivity,specificity were conducted.The RT-PCR method for detection of avian influnza virus subtype N9was established.Subtype H7N9and H10N9was positively while others were showed a negative result.The sensitivity of this method was 1/32hemagglutinin unit for subtype H7N9.The method is convenient，low cost and suitble for popularization and application.

Avian influenza virus;N9subtype;RT-PCR

2015-05-17

喬明明(1980-)，女，山東煙臺人,碩士,主要從事動物疫病診斷學研究。*通訊作者

S855.3

A

1007-5038(2016)01-0025-04