周信榮，宋德平，彭 棋，陳燕君，李安琪，張帆帆，吳 瓊，唐玉新

(江西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江西南昌 330045)

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豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定、毒力基因檢測及藥敏試驗

周信榮，宋德平，彭 棋，陳燕君，李安琪，張帆帆，吳 瓊，唐玉新*

(江西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江西南昌 330045)

2015年3月，江西省上饒市萬年縣某規(guī)?；B(yǎng)豬場部分肥豬出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、咳嗽等癥狀，部分發(fā)病豬出現(xiàn)死亡，病死率為35%，疑似豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染。用TSA及鮮血培養(yǎng)基進行了胸膜肺炎放線桿菌的分離和純化，經(jīng)培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化試驗及16S rDNA PCR鑒定等證明了分離菌為生物Ⅰ型胸膜肺炎放線桿菌。毒力基因檢測表明該菌具有ApxⅣ毒力基因。藥敏試驗結果顯示，分離菌對頭孢哌酮、諾氟沙星高度敏感，對青霉素G耐藥。

豬胸膜肺炎放線桿菌；分離鑒定；ApxⅣ毒力基因；藥敏試驗

豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起豬的一種急性呼吸系統(tǒng)傳染病[1]，APP是一種革蘭陰性小桿菌[2]，在適宜的培養(yǎng)基中，該菌菌落表面光滑、圓形、稍突起、邊緣整齊、針尖大小。根據(jù)其生長是否需要煙堿腺嘌呤二核苷酸(NAD)可分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[1]。生物Ⅰ型的生長依賴NAD的存在，能在含NAD和小牛血清的胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(TSA)平板上生長，在血平板上出現(xiàn)溶血現(xiàn)象；當有葡萄球菌存在時，在葡萄球菌生長區(qū)周圍溶血現(xiàn)象加強(CAMP現(xiàn)象)。生物Ⅱ型APP可以在沒有葡萄球菌和NAD存在的血瓊脂培養(yǎng)基上生長[3-5]。APP引起的豬群發(fā)病分為最急性、急性和慢性胸膜肺炎[6]，發(fā)病豬主要出現(xiàn)體溫上升到41℃左右，沉郁、厭食、呼吸困難、咳嗽，鼻子、耳朵、腿上的皮膚乃至全身發(fā)紅甚至發(fā)紺等臨床癥狀[7]。剖檢時，病理變化主要出現(xiàn)在呼吸道和肺部，局灶性病變且界限明顯，形成纖維素性胸膜炎，肺實質(zhì)與胸膜壁粘連[8]。APP有Apx Ⅰ、Apx Ⅱ、Apx Ⅲ和Apx Ⅳ 4種毒力基因，分別分泌Apx Ⅰ、Apx Ⅱ、Apx Ⅲ和Apx Ⅳ 4種溶細胞毒素(RTX)。其中，APP的Apx Ⅳ毒力基因表達分泌的Apx Ⅳ溶細胞毒素(RTX)是主要的致病因子之一[9-11]。2015年3月下旬，江西省上饒市萬年縣某規(guī)?；B(yǎng)豬場部分肥豬出現(xiàn)體溫升高、呼吸困難、咳嗽等疑似豬傳染性胸膜肺炎的癥狀，并有部分發(fā)病豬出現(xiàn)死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)死亡肥豬肺臟大面積肝樣變、嚴重充血,部分死亡豬肺臟化膿、肺表面出現(xiàn)粘連現(xiàn)象，疑似APP感染。取典型發(fā)病豬肺臟進行病原菌的分離鑒定、毒力基因檢測及藥敏試驗，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2015年3月，病料采集來自江西省上饒市萬年縣某規(guī)模化養(yǎng)豬場的發(fā)病育肥豬病變肺臟。

1.1.2 培養(yǎng)基 含NAD及小牛血清的TSA平板、含血清但不含NAD的TSA平板、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基等。

1.1.3 其他試劑及物品 金黃色葡萄球菌菌種，由江西農(nóng)業(yè)大學預防獸醫(yī)實驗室保存；生化試管及藥敏試紙為杭州天河生化有限公司產(chǎn)品；Taq酶等PCR反應試劑、pMD18-T vector為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；TOP10感受態(tài)細胞為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 16S rDNA和Apx Ⅳ毒力基因PCR引物序列 16S rDNA細菌通用引物27F/1492R(上游：5′- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3′；下游：5′-ACCTTGTTACGACTT-3′)；Apx Ⅳ 毒力基因引物采用劉婉婧等[12]設計的Apx Ⅳ毒力基因引物(上游：5′- CGCGAATTCATGGAGCAACAACGTCGCACAATT-3′；下游：5′- ATAGTCGACATCACCGTCAGTGCCAA-3′)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化及染色鏡檢 無菌操作將發(fā)病豬肺臟病料處理后接種于TSA固體平板(每100mL培養(yǎng)基含小牛血清3mL和100μL 0.1g/L NAD輔酶)及鮮血平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，挑單個菌落染色鏡檢。將疑似APP的菌落接種到新的TSA培養(yǎng)基上進行傳代純化。

1.2.2 生化試驗 無菌操作挑取純化后的單個菌落分別接種于脲酶、甘露醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷等微量生化發(fā)酵管(含1μL 0.1g/L NAD)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察發(fā)酵結果。

1.2.3 衛(wèi)星生長現(xiàn)象試驗 將金黃色葡萄球菌單個菌落在不含NAD的鮮血培養(yǎng)基上劃一橫線，在橫線的兩側垂直橫線畫線接種分離菌；同時，在涂布有分離菌的不含NAD的血清培養(yǎng)基上將金黃色葡萄球菌劃一橫線接種于培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)24h，觀察是否出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象。

1.2.4 16S rDNA PCR擴增、測序及序列比對分析 用接種環(huán)從TSA平板上刮取3個～5個純化的菌落洗脫于含100μL滅菌雙蒸水中。用磁珠法細菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離菌基因組DNA，按照試劑盒說明書操作，獲得的DNA用NanoDrop 2000(Thermo Scientific,USA)測定其濃度。以基因組DNA為模板，采用細菌通用引物27F/1492R擴增細菌 16S rDNA[12]。取5μL PCR產(chǎn)物電泳，觀察條帶的大小。將含目的基因片段的PCR產(chǎn)物純化、克隆后測序，獲得的序列在NCBI Blast上比對分析。

1.2.5 Apx Ⅳ毒力基因PCR擴增、測序及分析 以提取的分離菌DNA為模板，用文獻[13]設計的Apx Ⅳ毒力基因引物，PCR擴增 Apx Ⅳ毒力基因。將含目的基因片段的PCR產(chǎn)物純化、克隆后測序，獲得的序列用DNAStar(Version 7.10)及MEGA6.02軟件進行編輯、組裝、構建進化樹等分析。

1.2.6 藥敏試驗 參照Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)推薦的藥敏試驗方法進行。將鑒定的分離菌接種于含血清及NAD的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中，220r/min振蕩培養(yǎng)8h～12h。將培養(yǎng)好的細菌(濃度稀釋至1×108CFU/mL～1.5×108CFU/mL)均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，待液體吸干后將藥敏試紙輕輕貼在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，記錄抑菌直徑并根據(jù)常規(guī)藥敏試驗判定標準判斷分離菌株對不同抗菌藥的敏感程度[14]。

2 結果

2.1 分離菌的鑒定及培養(yǎng)特性

在含NAD的TSA培養(yǎng)基上生長出直徑1mm左右的表面光滑、圓形、邊緣整齊、稍突起、針尖大小的菌落(圖1)；在接種了金黃色葡萄球菌的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上越靠近金黃色葡萄球菌線的細菌長勢越好，說明分離菌的生長依賴NAD的存在，為生物Ⅰ型。革蘭染色鏡檢觀察結果表明，分離菌為革蘭陰性的小球桿菌(圖2)。

2.2 生化試驗結果

將純化菌接種到微量生化發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24h后觀察發(fā)現(xiàn)分離菌株對脲酶水解試驗、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖試驗呈陽性；對山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、七葉苷試驗呈陰性(表1)。

2.3 16S rDNA PCR鑒定及序列分析結果

經(jīng)PCR擴增后得到約1500bp大小的16S rDNA目的條帶(圖3)。目的條帶進行T-A克隆后，陽性重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對，確定為豬胸膜肺炎放線桿菌。同時將16S rDNA序列提交到GenBank，登錄號為KR071801。

2.4 Apx Ⅳ毒力基因PCR擴增及序列分析

經(jīng)PCR擴增后得到約1200bp大小的ApxⅣ毒力基因目的條帶(圖4)。目的片段進行T-A克隆后，陽性菌液送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果在GenBank上進行比對，確定為豬胸膜肺炎放線桿菌Apx Ⅳ毒力基因。同時將Apx Ⅳ毒力基因序列提交到GenBank上，獲得的登錄號為KR089051。采用MEGA6.02軟件中的Maximum Likeihood tree的方法制作APP毒力基因序列進化樹(圖5)，進化樹分析表明，分離菌與APP strain JX2014ApxⅣA(295474)親緣關系最近，與APP RTX ApxⅡA(AF363362)親緣關系較遠。

圖1 TSA平板菌落形態(tài)
Fig.1 Colonial morphology on TSA culture medium

圖2 革蘭染色菌體形態(tài)(40×100)
Fig.2 Bacterial morphology stained with Gram(40×100)

表1 分離菌株的部分生化試驗結果Table 1 The results of biochemical tests of the isolate

1.PCR產(chǎn)物; 2.DNA 標準DL 2000
1.PCR products; 2.DNA Marker DL 2000

圖3 分離菌16S rDNA PCR擴增結果
Fig.3 PCR results of the isolate 16S rDNA

1.PCR產(chǎn)物; 2.DNA 標準DL 2000
1.PCR products; 2.DNA Marker DL 2000

圖4 分離菌Apx Ⅳ毒力基因PCR擴增結果
Fig.4 PCR results of the isolate Apx Ⅳ toxin gene

2.5 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示，分離菌對諾氟沙星、頭孢哌酮、頭孢曲松鈉等藥物高度敏感，對氨芐西林、青霉素G、桿菌肽等藥物耐藥(表2)。

3 討論

APP感染豬后，可引起嚴重的呼吸系統(tǒng)病癥，導致豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)生，這不僅大大降低飼料報酬和增加藥物費用，也引起了一定的死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失。在臨床診斷上，豬傳染性胸膜肺炎易與豬瘟、豬鏈球菌病和豬丹毒等病混淆[5]，因此需通過細菌的分離純化、染色鏡檢和PCR等實驗室方法進行鑒別診斷。APP對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高，需要在培養(yǎng)基中添加一定量的小牛血清和NAD。根據(jù)“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象可區(qū)分生物Ⅰ型和生物Ⅱ型的APP。生物Ⅰ型為NAD依賴型放線桿菌，在含金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基上會出現(xiàn)“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象；生物Ⅱ型的生長則不依賴NAD，不會出現(xiàn)“衛(wèi)星生長”現(xiàn)象。

本研究利用TSA和血瓊脂分離到了病原菌并鑒定為APP生物Ⅰ型，該菌株具有APX Ⅳ毒力基因。APX Ⅳ所控制表達的APX Ⅳ溶血細胞毒素是APP主要的致病因子之一[9-11]。

圖5 APP 毒力基因進化樹(“●”為本次分離菌毒力基因序列)
Fig.5 The phylogenetic tree of APP toxin gene("●"represents the isolate of this study)

表2 分離菌株的部分藥敏試驗結果Table 2 Results of antimicrobial susceptibility tests of the isolate

隨著臨床生產(chǎn)實踐中抗菌藥物大量的使用，APP的耐藥性也越來越嚴重。從藥敏試驗結果來看，分離菌僅對頭孢哌酮、諾氟沙星等少量藥物敏感，對青霉素G、氨芐西林、四環(huán)素等大部分藥物耐藥，可將頭孢哌酮、諾氟沙星等少量藥物作為該豬場治療豬傳染性胸膜肺炎的首選藥物。與以往的報道不同的是，本次得到的分離菌株毒力出現(xiàn)增強，發(fā)病豬群不僅表現(xiàn)出嚴重的咳嗽、流鼻涕、發(fā)熱等癥狀，也導致了較高的病死率(35%)。因此，需進一步研究該菌的致病力和了解是否有其他病原的混合感染。由于病豬和帶菌豬是主要的傳染源[5,15-16]，因此加強生物安全工作，及時消毒，做好隔離工作，是防控豬傳染性胸膜肺炎的一種有效的辦法[17]。

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Isolation,Identification Toxic，Gene Detection and Antimicrobial Susceptibility Test of Actinobacillus pleuropneumoniae

ZHOU Xin-rong,SONG De-ping,PENG Qi,CHEN Yan-jun,LI An-qi,ZHANG Fan-fan,WU Qiong,TANG Yu-xin

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang,Jiangxi,330045,China)

In March 2015,some fattening pigs in Wannian,Shangrao City,Jiangxi province had high fever，acute respiratory distress syndrome and cough accompanied with 35% mortality,which resembled the manifestations of porcine contagious pleuropneumonia.To isolate and identify the causative agent(s),TSA and blood culture media were used.According to the results of culture characteristics，microscopic examination，biochemical test and PCR,the isolate was identified asActinobacilluspleuropneumoniaebiotype I.The consequence of identification of toxic gene showed that the isolated strain had Apx Ⅳ toxic gene.The results of antimicrobial susceptibility test demonstrated that the isolate was sensitive to cefoperazone and norfloxacin,but resistant to penicillin G.

Actinobacilluspleuropneumoniae; isolation and identification; Apx Ⅳ toxic gene; antimicrobial susceptibility test

2015-05-11

國家自然科學基金項目(31260611)；江西省科技廳落地計劃項目(KJLD13029)

周信榮(1990-)，男，江西廣豐人，碩士研究生，主要從事動物傳染病與病原學研究。*通訊作者

S852.619

A

1007-5038(2016)01-0067-05