鄭小龍，王 群，鄧明俊，張曉文，孫明君，朱來(lái)華

(山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002)

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西方馬腦炎病毒TaqMan MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立

鄭小龍，王 群，鄧明俊，張曉文，孫明君，朱來(lái)華

(山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島 266002)

通過(guò)RT-PCR從西方馬腦炎病毒(WEEV)中擴(kuò)增得到1317bp特異的保守序列，將其克隆到pMD-20T載體中，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，制備標(biāo)準(zhǔn)品cRNA。以10倍比稀釋的cRNA為模板，進(jìn)行TaqMan MGB熒光定量RT-PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了WEEV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。對(duì)建立的方法進(jìn)行了特異性和敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，建立的熒光定量RT-PCR方法最低可檢測(cè)10拷貝的cRNA；且與馬鼻肺炎病毒(EHV-1)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)、馬流感病毒(EIV,H3N8)、西尼羅病毒(WNV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)和日本腦炎病毒(JEV)不發(fā)生交叉反應(yīng)。與常規(guī)RT-PCR相比，該方法更加快速，特異性和敏感性更高,靈敏度為常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

西方馬腦炎病毒；TaqMan MGB；熒光定量RT-PCR

西方馬腦炎病毒(Wastern equine encephalitis virus,WEEV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，是引起西方馬腦炎的病原體。該病毒可經(jīng)呼吸道傳播感染，但主要通過(guò)蚊蟲(chóng)傳播[1]。西方馬腦炎可引起人和馬發(fā)病，病馬常呈亞臨床癥狀，病死率低于30%；WEEV對(duì)人的致死率明顯低于東方馬腦炎病毒[2-5]。該病在北美西部呈地方性流行，主要分布于加拿大、美國(guó)西部和中部，南美一些國(guó)家也有該病發(fā)生，如巴西、阿根廷、智利、秘魯和烏拉圭等國(guó)家[6]。

西方馬腦炎在我國(guó)也有報(bào)道，1990年何海懷等[7]從新疆烏蘇縣采集的按蚊和博樂(lè)縣采集的全溝硬蜱中分離出WEEV。呂新軍等[8]在對(duì)我國(guó)人體血清調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，WEEV抗體的陽(yáng)性率為2.71%，但在馬屬動(dòng)物中的流行情況未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。隨著我國(guó)馬術(shù)運(yùn)動(dòng)的發(fā)展，國(guó)際馬術(shù)比賽的日益頻繁，我國(guó)進(jìn)出境馬匹的數(shù)量也在不斷增加。為保障我國(guó)養(yǎng)馬業(yè)的健康發(fā)展，保證國(guó)際賽事的順利進(jìn)行，建立快速、敏感、特異的WEEV 熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法十分必要。本試驗(yàn)針對(duì)WEEV E1基因，篩選高度保守的片段，設(shè)計(jì)引物和探針，建立WEEVTaqMan MGB 熒光定量RT-PCR，并對(duì)其敏感性和特異性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及核酸 馬鼻肺炎病毒(EHV-1)、馬動(dòng)脈炎病毒(EAV)、馬流感病毒(H3N8)、西尼羅病毒(WNV)RNA、東方馬腦脊髓炎病毒(EEEV)RNA、西方馬腦炎病毒(WEEV)RNA和日本腦炎病毒(JEV)RNA均由山東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 臨床樣品 荷蘭進(jìn)口馬血樣18份，美國(guó)進(jìn)口馬血樣12份，俄羅斯進(jìn)口馬血樣12份，由山東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室收集并保存。

1.1.3 試劑 DNA/RNA提取試劑盒、連接試劑盒、DH5α、pMD20T和DNA Marker DL 2000均為TaKaRa公司產(chǎn)品；One-step RT-PCR試劑盒、TaqPCR mastermix為Qiagen公司產(chǎn)品；TaqMan RT- PCR試劑盒為ABI公司產(chǎn)品；SP6RiboMax Large Scale RNA Production System為Promega公司產(chǎn)品；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的WEEV基因序列，利用Mega 5.0軟件進(jìn)行分析，選擇保守區(qū)域，利用Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備。引物序列：T1:5′-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3′；T2:5′-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3′。根據(jù)熒光定量RT-PCR要求，利用Primer Express 3.0軟件在選取的保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)熒光定量RT-PCR引物和探針。引物和探針序列：P1：5′-GCGGGTCCCTCGAGTGTAA-3′；P2：5′-CAAAAACGCGGCATGTGTAA-3′；Probe：5′-NED-CATCCTCAAAGGCG-MGB-3′。引物和探針均由英駿生物科技有限公司合成。

1.2.2 WEEV基因特異性保守片段的擴(kuò)增 以WEEV RNA為模板，加入適量T1、T2；5×RT-PCR buffer；dNTP和Enzyme mix進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為： 50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 45s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。反應(yīng)完畢，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，于10g/L瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中以100V電壓進(jìn)行電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備 用T1和T2引物按照1.2.1的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將RT-PCR產(chǎn)物按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行切膠回收，連接至pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，挑選經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒,送英駿生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD20T-WEE。

選用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ將重組質(zhì)粒pMD20T-WEE進(jìn)行線性化，并純化回收，用SP6RiboMax Large Scale RNA Production System試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)無(wú)RNase的DNase消化后除去其中的DNA，然后用RNeasy Kit 進(jìn)行純化，制備出所需的cRNA。用核酸蛋白分析儀測(cè)定cRNA濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。

1.2.4 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 以樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)、產(chǎn)物熒光值、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和相關(guān)系數(shù)等為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)熒光RT-PCR反應(yīng)體系中的引物濃度(100、200、400、600、800nmol/L)，探針濃度(50、100、200、300、400nmol/L)和反應(yīng)參數(shù)中循環(huán)數(shù)(35、40、45個(gè)循環(huán))、反應(yīng)溫度(58、60、62℃)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用10倍系列稀釋法處理pMD20T-WEE cRNA標(biāo)準(zhǔn)品。取7個(gè)濃度梯度 (108、107、106、105、104、103拷貝和102拷貝) cRNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，以優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行熒光RT-PCR 反應(yīng)。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 的動(dòng)力學(xué)曲線，檢測(cè)儀系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

1.2.6 熒光定量RT-PCR方法特異性和敏感性試驗(yàn) 分別提取EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV的核酸，用所建立的熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，用ddH2O作為陰性對(duì)照。收集熒光信號(hào)，檢測(cè)其特異性。

用ddH2O對(duì)標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行10×系列稀釋，取1copies/μL～1.0×108copies/μL用所建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)各個(gè)稀釋度的樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用常規(guī)RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用建立的熒光RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR對(duì)荷蘭進(jìn)口的馬血樣18份，美國(guó)進(jìn)口馬血樣12份，俄羅斯進(jìn)口馬血樣12份進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備

將擴(kuò)增得到的WEEV基因特異性保守片段克隆至pMD20T載體中，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備出所需的cRNA作為陽(yáng)性模板，對(duì)其進(jìn)行RT-PCR鑒定，得到1317bp的片段(圖1)。經(jīng)序列測(cè)定，擴(kuò)增得到的特異性保守序列與GenBank中登陸序列同源性達(dá)到100%。

2.2 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件確立

為確保熒光定量RT-PCR的高效性、特異性及敏感性，對(duì)其反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。由試驗(yàn)結(jié)果可知，反應(yīng)的最佳引物和探針濃度分別為400nmol/L和200nmol/L，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為45個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用試劑盒純化pMD20T-WEE cRNA標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其OD值，通過(guò)公式計(jì)算得到其濃度為2.3×1010copies/μL。稀釋cRNA至1.0×1010copies/μL作為母液備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：把含有1.0×1010copies/μL的cRNA母液10倍比稀釋，分別以1×102～1.0×108

copies/μL稀釋度的cRNA為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量RT-PCR，以起始模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，Ct值與拷貝數(shù)濃度在1×102copies/μL～1.0×108copies/μL之間呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為y=49.28-3.72logx，R2=0.999。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2000；1，2.cRNA RT-PCR產(chǎn)物
M.DNA Marker DL 2000；1，2.RT- PCR products of cRNA

圖1 cRNA的RT-PCR鑒定
Fig.1 RT-PCR identification of cRNA

圖2TaqMan MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)WEEV的標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.2 Standard curve of WEEV detected byTaqMan MGB real-time PCR

2.4 熒光定量RT-PCR方法特異性、敏感性

用建立的TaqMan MGB熒光定量RT-PCR方法對(duì)EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，只有WEEV樣本呈現(xiàn)擴(kuò)增曲線(圖3)。將cRNA標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖4，由圖4可知，所建立的檢測(cè)方法在10copies/μL時(shí)，仍有熒光曲線,拷貝數(shù)濃度在1copies/μL時(shí)，無(wú)擴(kuò)增。核酸濃度為1.0×103copies/μL時(shí)普通RT-PCR后電泳可見(jiàn)到清晰條帶(圖5)，進(jìn)一步稀釋檢測(cè)不到目的條帶，因此所建立方法的靈敏度為常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

用建立的方法對(duì)42份進(jìn)口馬血樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)成立，42份馬血樣均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，WEEV檢測(cè)為陰性。同時(shí)用普通RT-PCR方法對(duì)其檢測(cè)，二者符合率為100%。

圖3 WEEV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法特異性分析
Fig.3 Analytical specificity of the real-time RT-PCR for WEEV

圖4 WEEV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法敏感性分析
Fig.4 Analytical sensitivity of the real-time RT-PCR for WEEV

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1～7.1.0×107copies/μL～1.0×101copies/μL cRNA RT-PCR 產(chǎn)物;8.空白對(duì)照
M.DNA Marker DL 2000;1-7.1.0×107-1.0×101copies/μL cRNA RT-PCR products;8.Blank

圖5 WEEV RT-PCR檢測(cè)敏感性分析
Fig.5 Analytical sensitivity of the RT-PCR for WEEV

3 討論

西方馬腦炎是一種人獸共患病，主要通過(guò)蚊蟲(chóng)傳播給人和馬等動(dòng)物，主要侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病毒感染率較高，病愈后多留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[9]。由于該病屬于急性病毒性人獸共患傳染病，被國(guó)際社會(huì)列為生物恐怖的主要病原之一。隨著經(jīng)濟(jì)全球化的發(fā)展，國(guó)際間馬匹的交流也越來(lái)越頻繁，建立快速高效敏感的WEEV檢測(cè)方法，對(duì)于保障人們的健康和預(yù)防疫情的暴發(fā)具有重要意義。

目前，對(duì)于WEE的診斷主要是通過(guò)病原學(xué)和血清學(xué)兩個(gè)方面。病原學(xué)診斷雖然可以確診，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢出率低，且需要在生物安全三級(jí)以上實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行操作。血清學(xué)診斷中ELISA尚無(wú)商品化的試劑盒，血凝抑制試驗(yàn)受主觀因素影響較大，而且血清學(xué)方法存在著與其他病毒的交叉反應(yīng)問(wèn)題[9]。RT-PCR方法是一種快速敏感的檢測(cè)方法[10-12]，在一定程度上解決了上述問(wèn)題，但比熒光熒光定量RT-PCR其檢測(cè)特異性、靈敏度及檢測(cè)速度均稍遜一籌[13-15]。因此，建立WEEV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法就顯的尤其重要。

本試驗(yàn)以WEEV E1基因?yàn)槟繕?biāo)基因，應(yīng)用MEGA5.0軟件對(duì)其進(jìn)行分析，篩選保守片段，制備標(biāo)準(zhǔn)品cRNA，設(shè)計(jì)引物及MGB探針，建立了WEEV的TaqMan MGB熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)、產(chǎn)物熒光值、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和相關(guān)系數(shù)等，對(duì)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定循環(huán)數(shù)為45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)溫度為60℃,引物濃度為400nmol/L，探針濃度為200nmol/L。用建立的熒光定量RT-PCR對(duì)EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、EEEV和WEEV陽(yáng)性樣本進(jìn)行擴(kuò)增，只有WEEV樣本呈現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該方法特異性高，與其他馬屬動(dòng)物病毒無(wú)交叉反應(yīng)。將制備的cRNA標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋，進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)每個(gè)反應(yīng)加入10拷貝的cRNA時(shí)可以穩(wěn)定地檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，但當(dāng)加入1拷貝的cRNA時(shí)，檢測(cè)不到擴(kuò)增信號(hào)。因此該方法的最低檢測(cè)限為10拷貝。用普通RT-PCR可檢測(cè)到103拷貝的cRNA，因此本試驗(yàn)建立的熒光定量RT-PCR方法的靈敏度是普通RT-PCR方法的100倍。將所建立的方法應(yīng)用于臨床檢測(cè)，其與普通RT-PCR方法的檢測(cè)結(jié)果一致。因近期血液樣品保存較少，無(wú)法進(jìn)行大量的臨床應(yīng)用，我們會(huì)在后期的日常檢測(cè)中進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用與驗(yàn)證。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了靈敏、快速、特異的WEEVTaqMan MGB熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，該方法在進(jìn)出境動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫、流行病學(xué)調(diào)查及病原鑒定中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Development ofTaqMan MGB Real-time PCR for Detection of Western Equine Encephalitis Virus

ZHENG Xiao-long,WANG Qun,DENG Ming-jun,ZHANG Xiao-wen,SUN Ming-jun,ZHU Lai-hua

(ShandongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao,Shandong,266002,China)

The 1317bp specific and consensus sequence of Western equine encephalitis virus (WEEV) was amplified by RT-PCR and cloned into plasmid pMD-20T,RNA was transcribedinvitrousing linearised plasmid DNA.Serial dilutions of cRNA were used as standard templates for real-time RT-PCR to quantify the genomic copy number of WEEV．We developed aTaqMan MGB real-time RT-PCR to detect WEEV.Sensitivity analysis showed that the developedTaqMan MGB real-time RT-PCR could detect 10copies/μL．The specificity assay exhibited that negative control and the other equine pathogens could not be detected.The result demonstrated a 100fold sensitivity of the real-time RT-PCR assay was developed compared with gel-based real-time RT-PCR method.

Western equine encephalitis virus;TaqMan MGB;real-time RT-PCR

2015-06-09

國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2014IK240)

鄭小龍(1979-)，男，山東平邑人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事進(jìn)出境動(dòng)物檢疫研究。

S855.3

A

1007-5038(2016)01-0006-05