王文珺，高隆軒，米振杰，吳雨洋，王照鵬，蘇麗芳，韓 霄，邢佑尚

(1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京 100095；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100193；3.河北獸藥監(jiān)察所，河北石家莊 050035；4.北京交通大學(xué)理學(xué)院，北京 100044)

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大觀霉素間接競爭ELISA的建立

王文珺1，高隆軒2，米振杰3，吳雨洋1，王照鵬1，蘇麗芳1，韓 霄4，邢佑尚1

(1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京 100095；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100193；3.河北獸藥監(jiān)察所，河北石家莊 050035；4.北京交通大學(xué)理學(xué)院，北京 100044)

本研究的目的是建立大觀霉素的間接競爭性ELISA(icELISA)，用于動物源性食品的檢測。在優(yōu)化的條件下，建立了大觀霉素icELISA的標(biāo)準曲線，半抑制濃度IC50=1.78ng/mL。多克隆抗體對大觀霉素的特異性較強，與其他氨基糖苷類化合物有微小的交叉。分別對20份空白的牛奶、豬肉、雞肉進行檢測，確定這些樣本中大觀霉素的檢測限分別是4.8、9.3、10.0μg/kg。在樣本中添加不同濃度的大觀霉素，添加回收率的范圍為77.1%～116.0%，變異系數(shù)為4.6%～9.7%；ELISA和GC/MS兩種方法分析結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，本研究成功建立了大觀霉素的icELISA，用于檢測牛奶、豬肉、雞肉中大觀霉素，準確度和精密度均滿足獸藥殘留檢測的要求。

大觀霉素；間接競爭ELISA；動物性食品

大觀霉素(spectinomycin，SPE)是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，Mason于1961年首次從鏈霉菌中分離得到[1]。從結(jié)構(gòu)上講，大部分氨基糖苷類抗生素分子中含有氨基糖苷結(jié)構(gòu)，而SPE(圖1)只具有氨基環(huán)醇，沒有氨基糖苷結(jié)構(gòu)，但包括中華人民共和國獸藥典(2010版)在內(nèi)的許多文獻資料都把SPE歸為氨基糖苷類藥物。在臨床中，SPE多采用鹽酸大觀霉素的形式，它是常用的治療豬的細菌性腸炎和雞的呼吸道疾病的口服藥物[2]。SPE常被用作畜禽飼料添加劑，用于治療和預(yù)防疾病。與其他抗生素一樣，SPE在畜禽養(yǎng)殖中被嚴重濫用，在動物體內(nèi)蓄積，并通過食物鏈傳遞給人類，相當(dāng)于長期低劑量的服用SPE，導(dǎo)致肌體內(nèi)細菌的耐藥性增加，進而破壞肌體的抵抗力，引發(fā)過敏反應(yīng)、聽神經(jīng)損害等。農(nóng)業(yè)部“235”號公告明確規(guī)定了大觀霉素在動物性食品中的殘留限量為500μg/kg，在牛奶中不得超過200μg/L[3]。GB 29685-2013規(guī)定檢測動物性食品中大觀霉素的方法是GC/MS[4]。

圖1 大觀霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式
Fig.1 The chemical structure of spectinomycin

建立大觀霉素殘留快速檢測方法具有重要意義。本研究在前期抗原抗體制備的工作基礎(chǔ)上[5]，建立了SPE的ELISA檢測體系及其在動物源性食品中殘留的檢測方法，基于此項研究工作開發(fā)的檢測試劑已實現(xiàn)商品化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 大觀霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素購自中國藥品與生物制品鑒定所；羊抗兔酶標(biāo)二抗、牛血清白蛋白(BSA)、Proclin 300、明膠、Tween-20、酪蛋白等為Sigma公司產(chǎn)品；ELISA酶標(biāo)板為深圳金燦華公司產(chǎn)品；新生牛血清為北京元亨生物產(chǎn)品；其他分析純化合物均為北京國藥集團產(chǎn)品；大觀霉素包被抗原、大觀霉素多克隆抗體由本公司制備。

ELISA所用的緩沖溶液：

(1)包被緩沖液：0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6。

(2) 磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L，PBS)：1000mL 0.01mol/L PB緩沖液中加入8.5g NaCl，0.02g KCl，pH 7.4。

(3)洗滌液：1000mL PBS加入0.5mL Tween-20。

(4) 酶稀緩沖液：2mL Tween-20、1g明膠、200mL新生牛血清(使用前56℃滅活30min)、0.2g酪蛋白和300μL ProClin 300，加入到0.02mol/L PBS中，定容到1000mL。

(5)封閉液：1000mL PBS加入2.5g酪蛋白、30g/L BSA、50g/L蔗糖和300μL ProClin 300。

(6)抗體稀釋液：0.01mol/L PBS中加入300μL ProClin 300、200μL Triton 100、1g/L BSA，定容到1000mL。

1.1.2 儀器 MK3酶標(biāo)儀為Thermo fisher公司產(chǎn)品；TDL-40C離心機由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；HQ-60型渦動儀為北京方正生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；電子分析天平為德國賽多利斯科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水儀為Milli-Q 公司產(chǎn)品；微量移液器為Eppendorf公司產(chǎn)品；SH-2微孔板脫水儀由北京雙和盛源科技發(fā)展中心提供。

1.2 方法

1.2.1 SPE抗原抗體制備 SPE抗原抗體制備流程見本項目組的前期研究報道[5]。

1.2.2 建立大觀霉素的標(biāo)準抑制曲線 首先，用方陣法篩選包被抗原、抗體的工作濃度，并對包被方式、加樣體系進行選擇，然后建立SPE的icELISA標(biāo)準曲線。

(1)包被：根據(jù)方陣法確定的濃度稀釋包被抗原，每孔100μL，4℃過夜包被(16h)，棄包被液，洗滌1次。

(2)封閉：在每孔中加入150μL封閉液，室溫下封閉2h，棄封閉液，甩干。

(3)干燥：將甩干后的酶標(biāo)板倒扣于37℃恒溫箱中，干燥1h。

(4)加樣：將50μL不同濃度的SPE標(biāo)準品平行加入微孔中，標(biāo)準品濃度設(shè)置為：0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2ng/mL。然后順序加入50μL酶標(biāo)二抗工作液、50μL SPE抗體，室溫下(25℃±2℃)，避光反應(yīng)30min，洗滌4次。

(5)顯色：在每孔中加入按照同樣比例剛混合的底物緩沖液100μL，避光孵育8min～10min。

(6)讀數(shù)：每孔加入50μL終止液終止，5min內(nèi)在450nm/630nm 雙波長下讀出數(shù)據(jù)。

以SPE標(biāo)準品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，不同濃度的SPE標(biāo)準品的結(jié)合率為縱坐標(biāo)，用軟件Origin 8.0繪制標(biāo)準曲線，建立四參數(shù)回歸方程?；貧w方程如下：

其中Y為結(jié)合率，A1代表最低濃度標(biāo)準品的結(jié)合率，A2是最高濃度標(biāo)準品的結(jié)合率，P為曲線拐點的斜率，X0為IC50。

1.2.3 抗體的特異性 以icELISA法分別考察SPE抗體與氨基糖苷類抗生素慶大霉素、新霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素、鏈霉素的交叉反應(yīng)率，建立上述藥物的標(biāo)準抑制曲線，并計算各自的IC50，按下式計算交叉反應(yīng)率：

交叉反應(yīng)(CR%)=IC50(SPE)/IC50(有關(guān)化合物)×100%

1.2.4 樣品分析

1.2.4.1 牛奶樣品 準確量取0.1mL牛奶樣品于2mL離心管中，加入0.9mL 含0.01% Tween-20的去離子水，慢速渦動混勻后取50μL進行檢測。稀釋倍數(shù)10。

1.2.4.2 組織樣品 準確稱取1g±0.01g均質(zhì)后的組織樣品(豬肉、雞肉)于50mL離心管中，加入5mL 0.01mol/L PBS，充分渦動1min；4000r/min離心10min；取200μL上清于新的離心管中，再加入400μL 0.01mol/L PBS，充分渦動20s；取50μL進行檢測。稀釋倍數(shù)18。

2 結(jié)果

2.1 SPE標(biāo)準抑制曲線

對各種工作條件(包括抗原、抗體濃度、酶標(biāo)二抗?jié)舛?、包被方式、抗體稀釋液、加樣體系、反應(yīng)時間等)進行優(yōu)化。根據(jù)IC50和ODmax確定最佳工作濃度，總原則是選擇使標(biāo)準曲線IC50值更低、ODmax范圍在1.8～2.2的工作條件。圖2是使用四參數(shù)擬合的SPE標(biāo)準曲線，IC50=1.78ng/mL，R2=0.993。

圖2 SPE標(biāo)準曲線
Fig.2 The standard curve for SPE

2.2 抗體特異性

本研究所用的SPE多克隆抗體與氨基糖苷類抗生素的交叉反應(yīng)情況如表1，SPE抗體與其他氨基糖苷類化合物有輕微交叉，說明抗體的特異性強，可以特異的檢測待測樣品中SPE。

表1 SPE與結(jié)構(gòu)類似物化合物的交叉反應(yīng)率Table 1 The cross-reactivity of SPE with related compounds

2.3 樣品檢測

2.3.2 添加試驗 準確度和精密度是評價檢測方法可靠性的重要指標(biāo)，在ELISA工作中，準確度和精密度分別用回收率和變異系數(shù)表示。根據(jù)檢測線性范圍及檢測要求，SPE在牛奶中的添加濃度為4.8μg/L、9.6μg/L，在雞肉中的添加濃度為9.3μg/kg、18.6μg/kg，在豬肉中添加濃度為10μg/kg、20μg/kg。每種樣品分別取3個不同批次，每個批次5個樣本，按照本試驗確定的ELISA方法檢測并計算批內(nèi)和批間的回收率及其變異系數(shù)。

表2 SPE在3種樣本的回收率和變異系數(shù)Table 2 The recoveries and coefficient of variation in the three samples of SPE

從表2可以看出，在牛奶、雞肉、豬肉樣品中添加不同濃度的大觀霉素，批內(nèi)添加回收率在77.1%至116.0%，批內(nèi)變異系數(shù)在4.6%至9.7%，批間添加回收率在82.3%至118.2%，相應(yīng)的批間變異系數(shù)在6.8%至12.3%。無論是批內(nèi)還是批間，所有樣本的添加回收率均在70%至120%之間，變異系數(shù)也都小于15%。說明建立的檢測SPE殘留的ELISA方法在準確性和精密度上達到了獸藥殘留檢測的要求[6]。

2.3.3 與儀器分析比較ELISA與GC/MS比較結(jié)果見表3。GC/MS條件：色譜柱，毛細管色譜柱Rtx-5，30m×0.25mm；載氣，氦氣；柱流速：1mL/min；進樣體積：1μL；進樣口溫度：280℃；掃描離子145、171、187、201。

表3 IcELISA測定結(jié)果與GC/MS測定結(jié)果的比較Table 3 The comparison of results determined by indirect competitive ELISA and GC/MS

GC/MS檢測限是50μg/kg(μg/L)，這個濃度的SPE對于ELISA來說，還需要進一步稀釋才能分析。牛奶樣品需要稀釋10倍，組織樣品稀釋5倍后應(yīng)用于ELISA。由表3可知，經(jīng)單因素方差分析，兩種方法的分析結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)，進一步說明，本研究所建立的ELISA方法可用于牛奶及組織樣品中SPE的檢測。

3 討論

隨著精準農(nóng)業(yè)的發(fā)展，獸藥殘留檢測方法的研究成為化學(xué)分析領(lǐng)域的一大熱點[7-8]。本研究工作的目的是建立大觀霉素的ELISA方法并將其應(yīng)用于實際檢測中。關(guān)于大觀霉素免疫分析方法，國內(nèi)外報道較少，但都局限于抗體制備及ELISA方法建立，沒有關(guān)于應(yīng)用性的研究報道[1,5,9]。

研究過程中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時間的長短對最后的反應(yīng)結(jié)果會有很大的影響。抗原-抗體的結(jié)合是一個動態(tài)平衡的過程，需要一定的反應(yīng)時間達到所謂的“平衡”的狀態(tài)。時間過短則體系還沒有充分反應(yīng)，這種情況下中斷反應(yīng)會使得反應(yīng)結(jié)果太過依賴操作時間，重復(fù)性不好；時間過長雖然反應(yīng)已充分，但過長的反應(yīng)時間導(dǎo)致外界影響因素增多，使得反應(yīng)出現(xiàn)不正常的平衡移動，從而干擾反應(yīng)結(jié)果，影響檢測的準確性。在本研究中，反應(yīng)時間30min時反應(yīng)已達到平衡，此時反應(yīng)靈敏度最高。隨著時間的推移，靈敏度反而變小，因此選擇反應(yīng)時間為30min比較合理。

為滿足市場對快檢產(chǎn)品的要求，本研究依靠高靈敏度的抗原、抗體，通過對各種條件進行優(yōu)化，采用“一步法”(one-step)，即標(biāo)準品、酶標(biāo)二抗、一抗按照順序先后加入微孔板并進行孵育反應(yīng)，而不是分成“標(biāo)準品+一抗”、“酶標(biāo)二抗”兩步進行，減少了其中的洗板過程，簡化了反應(yīng)步驟，適應(yīng)了市場對快檢產(chǎn)品“快”的要求。在我們前期工作中，“一步法”ELISA在一些產(chǎn)品檢測中已得到應(yīng)用，以期達到縮短反應(yīng)時間，簡化操作步驟的目的[10-11]。

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[2]MedinaAB.Developmentofafluorescentlateximmunoassayfordetectionofaspectinomycinantibiotic[J].JAgriFoodChem,2004,52:3231-3236.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.GB29685-2013動物性食品中林可霉素、克林霉素和大觀霉素多殘留的測定氣相色譜-質(zhì)譜法 [S].2013-09-16.

[4] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部235號公告：動物性食品中獸藥殘留最高限量[EB/OL].http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/2002-12-24.

[5] 王照鵬，李向梅，王文珺，等.大觀霉素人工抗原的合成及其多克隆抗體制備[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41(2)：54-57.

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[8] 薛 曉，榮 霞，葉自霞，等.膠體金免疫層析法在畜禽產(chǎn)品獸藥殘留檢測中的應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34(12)：179-182.

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Development of an Indirect Competitive ELISA for Determination of Spectinomycin in Animal-origin Food

WANG Wen-jun1,GAO Long-xuan2,MI Zhen-jie3,WU Yu-yang1,WANG Zhao-peng1,SU Li-fang1,HAN Xiao4,XING You-shang1

(1.BeijingWDWKBiotechnologyCo.Ltd.,Beijing,100095,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China; 3.HebeiInstituteofVeterinaryDrugControl,Shijiazhuang,Hebei,050053,China; 4.CollegeofScience,BeijingJiaotongUniversity,Beijing,100044,China)

The objective of this work was to establish an indirect competitive ELISA for the determination of spectinomycin in animal-origin food.Under optimized condition,the half maximal inhibitory concentration (IC50) is 1.78ng/mL.The limit of detection for milk,pork and chicken are 4.8μg/L,9.3μg/kg and 10.0μg/kg,respectively.The samples were spiked with spectinomycin and the recoveries were 77.1%-116.0%; the coefficients of variation were 4.6%-9.7%.There were no significant differences between the results of ELISA and GC/MS(P>0.05).The results showed an indirect competitive ELISA for spectinomycin was established successfully and this method was primarily applied to detect spectinomycin in animal-origin food.

spectinomycin; icELISA; milk; animal-origin food

2015-06-10

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAK17B16)；河北省科技計劃項目(15277107D)

王文珺(1975-)，女，山西陽高人，副研究員，博士，主要從事食品安全檢測研究。

S859.796

A

1007-5038(2016)01-0043-04