李嘉欣，解彩霞，錢 多，蘇 燕*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014030)

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應(yīng)用血紅蛋白釋放試驗(yàn)研究維生素C對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

李嘉欣1，解彩霞1，錢 多2，蘇 燕1*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古包頭 014030)

為了研究維生素C對(duì)氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用，用終濃度為0、2.5、5、10、20、40mL/L的過氧化氫(H2O2)溶液處理等體積維生素C作用后紅細(xì)胞懸液(維生素C保護(hù)組)和維生素C未作用紅細(xì)胞懸液(對(duì)照組)，測(cè)定紅細(xì)胞相對(duì)溶解度和高鐵血紅蛋白(MetHb)含量，并用血紅蛋白釋放試驗(yàn)比較血紅蛋白(Hb)釋放差異。結(jié)果表明，維生素C保護(hù)組Hb釋放量和相對(duì)溶解度均明顯低于對(duì)照組(P<0.001)，MetHb含量雖然低于對(duì)照組(P<0.05)，但與H2O2濃度無相關(guān)性。說明維生素C對(duì)紅細(xì)胞膜氧化損傷具有保護(hù)作用，并能減弱Hb釋放和MetHb的生成量。

維生素C；紅細(xì)胞；血紅蛋白釋放試驗(yàn)；過氧化氫；高鐵血紅蛋白

淀粉-瓊脂糖混合凝膠電泳主要用來觀察血紅蛋白(hemoglobin，Hb)的電泳行為，試驗(yàn)時(shí)不需要制備紅細(xì)胞裂解液，直接用全血電泳觀察，大大提高了研究效率[1]。2007年，由包頭醫(yī)學(xué)院秦文斌帶隊(duì)的血紅蛋白研究組在進(jìn)行1例輕型β-地中海貧血患者的紅細(xì)胞電泳過程中偶然發(fā)現(xiàn)了Hb再釋放現(xiàn)象，依此創(chuàng)建了血紅蛋白釋放試驗(yàn)(hemoglobin release test，HRT)[2-4]，并推測(cè)HRT可能與Hb和紅細(xì)胞膜之間的相互作用有關(guān)[5-6]。前期研究結(jié)果表明，過氧化氫處理紅細(xì)胞后會(huì)增加Hb再釋放[7]。維生素C是水溶性抗氧化物，本研究旨在通過HRT比較維生素C對(duì)過氧化氫氧化損傷的紅細(xì)胞是否具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討HRT可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液標(biāo)本 80份正常成人新鮮肝素抗凝靜脈血，取自包頭市第四醫(yī)院檢驗(yàn)科的健康體檢者。本研究得到包頭醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批，并在取血前與獻(xiàn)血者簽訂了知情同意書。血樣4℃保存，24h內(nèi)檢測(cè)。

1.1.2 主要儀器與試劑 水平電泳槽(北京六一，DYY-Ⅲ型)和穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(DYY-2C)為北京六一生產(chǎn)；高速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；17cm×17cm玻璃板等；淀粉、硼酸、Tris、EDTA、氨基黑、冰醋酸、乙醇、CCl4、30% H2O2等均為國(guó)產(chǎn)分析純；瓊脂糖為西班牙進(jìn)口分裝；維生素C注射液(250mg/mL)為瑞陽制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 紅細(xì)胞懸液和溶血液的制備 按照本室常規(guī)方法制備紅細(xì)胞懸液和溶血液[8]，將紅細(xì)胞懸液分為兩組，每組6份。維生素C保護(hù)組加入等體積濃度為0.625g/L 維生素C，對(duì)照組加入等體積生理鹽水。2h后，兩組分別加入0、2.5、5、10、20、40mL/L的H2O2溶液作用2h。

1.2.2 血紅蛋白釋放試驗(yàn) 按照本室常規(guī)方法配制淀粉-瓊脂糖混合凝膠[8]，各樣品紅細(xì)胞懸液分別吸取10μL，加在1cm×0.2mm濾紙條上，并將濾紙條插入凝膠。第1次電泳120V通電65min，斷電5min后再通電60min。泳畢，將凝膠板浸入氨基黑10B染色過夜，再用50mL/L冰醋酸溶液反復(fù)漂洗，觀察結(jié)果并拍照。

1.2.3 紅細(xì)胞相對(duì)溶解度測(cè)定 H2O2溶液作用紅細(xì)胞2h后，經(jīng)3000r/min離心5min，吸取50μL上清液，用生理鹽水稀釋6倍于540nm處測(cè)定吸光度值，以溶血液50倍稀釋液的吸光度值為參照吸光值，計(jì)算各樣品的相對(duì)溶解作用。相對(duì)溶解度=吸光值/參照吸光值×100%。

1.2.4 高鐵血紅蛋白含量測(cè)定 MetHb的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，按說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0軟件處理，用Two-way ANOVA檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維生素C組和對(duì)照組紅細(xì)胞懸液的Hb再釋放

隨著H2O2濃度逐漸升高，對(duì)照組Hb再釋放量逐漸增加，而維生素C保護(hù)組Hb再釋放量很少，且再釋放增加量不明顯(圖1、圖2)。

VC1～VC6.維生素C保護(hù)組；C1～C6.對(duì)照組VC1-VC6.維生素C protection groups; C1-C6.Control groups

圖1 不同濃度H2O2處理維生素C保護(hù)組和對(duì)照組紅細(xì)胞懸液的Hb再釋放
Fig.1 Released Hb of erythrocytes treated by different concentrations of H2O2in vitamin C protection groups and control groups

VC1～VC6.維生素C保護(hù)組；C1～C6.對(duì)照組；與對(duì)照組相比，*P<0.001
VC1-VC6.Vitamin C protection groups; C1-C6.Control groups；Compared with the control groups,*P<0.001

圖2 凝膠電泳圖譜中釋放Hb的半定量分析
Fig.2 Semi quantitative analysis of released Hb in gel electrophoresis

2.2 紅細(xì)胞相對(duì)溶解度測(cè)定

2.2.1 參照吸光值 將溶血液稀釋50倍，并測(cè)出540nm處的吸光值，取平均值0.623做為參照吸光值(表1)。

2.2.2 不同濃度過氧化氫處理后對(duì)紅細(xì)胞膜的作用 不同濃度H2O2處理維生素C保護(hù)組和對(duì)照組，結(jié)果顯示，維生素C保護(hù)組破膜程度與對(duì)照組組比較，P<0.001，差異極顯著。兩組隨H2O2濃度增大，破膜程度均依次增強(qiáng)，但維生素C保護(hù)組破膜率遠(yuǎn)小于對(duì)照組，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到4%時(shí)，維生素C 保護(hù)組相對(duì)溶解度為9%，而對(duì)照組達(dá)到18.9%(圖3)。

表1 參照吸光值Table 1 The standard OD

與對(duì)照組相比，*P<0.001
Compared with the control groups,*P<0.001

圖3 不同濃度H2O2處理后紅細(xì)胞的相對(duì)溶解度
Fig.3 The relative solubility of erythrocytes after H2O2treatment

2.3 不同濃度過氧化氫處理后高鐵血紅蛋白(MetHb)含量的變化

不同濃度H2O2處理維生素C保護(hù)組和對(duì)照組紅細(xì)胞懸液，測(cè)定各管MetHb含量，結(jié)果顯示維生素C保護(hù)組MetHb含量明顯低于對(duì)照組；對(duì)照組H2O2作用后的5份樣品MetHb生成量均高于無H2O2作用樣品，P<0.05，有顯著性差異。不同濃度H2O2作用時(shí)，維生素C組內(nèi)6份樣品之間比較，P=0.1785，MetHb生成量變化不顯著(圖4)。

與對(duì)照組相比，*P<0.05
Compared with the control groups,*P<0.05

圖4 不同濃度H2O2處理紅細(xì)胞后高鐵血紅蛋白含量的變化
Fig.4 Changes in the content of MetHb after treatment with different concentrations of H2O2

3 討論

紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)(HRT)是將未裂解的完整紅細(xì)胞加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進(jìn)行電泳，一次通電完成電泳，此時(shí)有血紅蛋白(Hb)釋放出來，稱為“初釋放”；如果在電泳釋放過程中進(jìn)行“斷電-再通電”，又會(huì)有Hb從原點(diǎn)釋放出來，稱為“再釋放”。正常情況下，初釋放時(shí)，紅細(xì)胞內(nèi)的大部分Hb都釋放出來，殘留較少；再釋放時(shí)，殘留Hb再次離開紅細(xì)胞，出現(xiàn)新的Hb區(qū)帶[3-8]。試驗(yàn)過程中，本研究組將這一技術(shù)不斷發(fā)展，并應(yīng)用于臨床病例的研究，比較了多種疾病及手術(shù)前后血液中紅細(xì)胞HRT結(jié)果的差異，證實(shí)很多患者均可以出現(xiàn)Hb再釋放增加。維生素C是血漿中最有效的抗氧化劑，通過還原作用一方面可以直接與氧自由基作用，清除氧自由基的毒性；另一方面，它作為供氫體，使被氧化的維生素E和巰基恢復(fù)為還原型，發(fā)揮了間接抗氧化作用。本研究首次將HRT應(yīng)用于觀察抗氧化物對(duì)紅細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，當(dāng)維生素C存在時(shí)，能夠明顯降低H2O2對(duì)紅細(xì)胞造成的氧化損傷，導(dǎo)致Hb再釋放量降低。HRT中釋放的Hb是與膜結(jié)合的Hb[7]，維生素C的存在可以保護(hù)膜的完整性，降低Hb與膜的結(jié)合，因此降低了Hb的再釋放。研究提示，HRT是一種快速、簡(jiǎn)單的方法，可以將其應(yīng)用于檢測(cè)各種抗氧化劑對(duì)紅細(xì)胞膜的保護(hù)作用。

血紅蛋白是由4個(gè)亞基和4個(gè)卟啉環(huán)組成的復(fù)雜蛋白質(zhì)，其卟啉環(huán)中的二價(jià)鐵在氧化劑存在條件下會(huì)被氧化成三價(jià)鐵，使Hb變?yōu)闊o載氧活性的高鐵血紅蛋白(MetHb)。在正常的生理?xiàng)l件下,人血紅細(xì)胞擁有一套完整的抗氧化系統(tǒng),包括超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT),谷胱甘肽過氧化物酶(GSHpx)等組成的抗活性氧酶系統(tǒng)和維生素E、維生素C、谷胱甘肽等非酶抗氧化劑[9]。當(dāng)Hb被氧化成MetHb時(shí)，紅細(xì)胞中的抗氧化系統(tǒng)就會(huì)產(chǎn)生一系列的消除Hb氧化變性的作用[10]。研究結(jié)果顯示，不同濃度H2O2作用時(shí)，維生素C保護(hù)組中，MetHb含量均低于對(duì)照組，但MetHb含量未表現(xiàn)與H2O2濃度相關(guān)，可能與H2O2濃度選取范圍有關(guān)。說明在紅細(xì)胞懸液中加入維生素C促進(jìn)了三價(jià)鐵向二價(jià)鐵轉(zhuǎn)化，且當(dāng)氧化劑濃度在一定范圍內(nèi)維生素C對(duì)Hb的保護(hù)作用不受氧化劑濃度的影響。HRT中維生素C保護(hù)組Hb再釋放增加量不明顯，提示MetHb產(chǎn)生后，是否更易與膜結(jié)合，推測(cè)Hb再釋放量增加可能與MetHb增加有關(guān)，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1] 李嘉欣，蘇 燕.紅細(xì)胞血紅蛋白釋放試驗(yàn)的臨床研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(10): 104-107.

[2] 秦文斌，高麗君，蘇 燕，等.血紅蛋白釋放試驗(yàn)與輕型β-地中海貧血[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23(6): 561-563.

[3] Su Y,Shao G,Gao L,et al.RBC electrophoresis with discontinuous power supply-a newly established hemoglobin release test[J].Electrophoresis,2009,30(17): 3041-3043.

[4] Su Y,Qin W.Protein electrophoresis: Methods in Molecular Biology：Interactions of Hemoglobin in Live Red Blood Cells Measured by the Electrophoresis Release Test[M].New York: Humana Press,2012.

[5] 魏春華，蘇 燕，楊 麗,等.不同的紅細(xì)胞破膜方法對(duì)血紅蛋白A2現(xiàn)象的影響[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，27(4): 1-2.

[6] Su Y,Gao L,Qin W.Interactions of hemoglobin in live red blood cells measured by the electrophoresis release test[J].Meth Mol Biol,2012,869: 393-402.

[7] 魏春華，蘇 燕，李曉晶，等.不同濃度過氧化氫處理紅細(xì)胞對(duì)血紅蛋白釋放的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(3): 64-67.

[8] 秦文斌.紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的電泳釋放——發(fā)現(xiàn)和研究[M].北京：科學(xué)出版社，2015.

[9] Davies K J A,Goldberg A L.Oxygen radicals stimulate intra celluar proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erythrocytes[J].J Biol Chem,1987，262(17): 8220-8226.

[10] Callel R W,Winterbourn C C,Rachmi lewitz E A.Activated oxygen and haemolysis[J].Br J Haematol,1975，30(3): 259.

Protective Effect of Vitamin C on Oxidative Damage to Erythrocytes by Using Hemoglobin Release Test

LI Jia-xin1,XIE Cai-xia1,QIAN Duo2,SU Yan1

(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BaotouMedicalCollege,Baotou，InnerMongolia，014060,China;2.ClinicalLaboratoryofTheFourthHospitalofBaotou,Baotou,InnerMongolia，014030,China)

In order to study the protective effect of vitamin C on the oxidative damage to erythrocytes，the final concentrations of 0,2.5,5,10,20，40mL/L hydrogen peroxide(H2O2) solution were used to treat same volume vitamin C treated erythrocyte suspension(vitamin C protection groups) and vitamin C untreated erythrocyte suspension (control groups).The relative solubility and met-hemoglobin(MetHb) content were measured,and the release of hemoglobin(Hb) was compared by hemoglobin release test(HRT).The results showed that the Hb release quantity and the relative solubility of vitamin C protection groups were significantly lower than those in control groups (P<0.001),although the MetHb lower than the control groups(P<0.05),it has no correlation with the concentration of H2O2.It showed that vitamin C has protective effects on erythrocyte membrane oxidation damage,and can decrease the amount of Hb release and MetHb formation.

vitamin C; erythrocyte; hemoglobin release test; hydrogen peroxide; met-hemoglobin

2015-07-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160214)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2010BS1101)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(NJZY14265)；秦文斌科技教育基金項(xiàng)目(201309)；內(nèi)蒙古衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010056)

李嘉欣(1982-)，女，遼寧鞍山人，講師，碩士，主要從事血液保護(hù)方面研究。*通訊作者

S852.33

A

1007-5038(2016)01-0022-04