王宗尉　肖佳音　李慶忠

(黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，黑龍江 哈爾濱 150001)

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醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼的生物學(xué)試驗(yàn)

王宗尉肖佳音李慶忠

(黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，黑龍江 哈爾濱 150001)

摘要目的觀察醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的皮膚致敏反應(yīng)、皮膚刺激反應(yīng)和細(xì)胞毒性反應(yīng)，為其作為醫(yī)療器械用途的生物安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。方法根據(jù)該產(chǎn)品與人體接觸方式及接觸時(shí)間，按照醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)選擇皮膚致敏試驗(yàn)，皮膚刺激試驗(yàn)，細(xì)胞毒性試驗(yàn)進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果未出現(xiàn)皮膚致敏反應(yīng)及皮膚刺激反應(yīng)，無(wú)細(xì)胞毒性。結(jié)論醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼臨床用于緩解和補(bǔ)償損傷使用是安全的。

關(guān)鍵詞醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼；醫(yī)療器械；生物安全性評(píng)價(jià)

文章編碼：1001-8131(2016)02-0142-02

透明質(zhì)酸鈉是一種天然直鏈大分子多糖，對(duì)其深加工后制成的醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠被廣泛用于眼科手術(shù)，防治外傷性或退變性骨關(guān)節(jié)炎，外科手術(shù)等。由透明質(zhì)酸鈉加工制得的醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼作為一種新型生物材料，用于修復(fù)皮膚疤痕，臨床對(duì)其安全評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道。因此我們對(duì)其進(jìn)行生物安全評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)告如下：

1資料與方法

1.1一般資料：①供試品：醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼，哈爾濱市天地仁醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)20130129，規(guī)格為5 cm×5 cm。②儀器設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱(thermo electron corporation，3111)，倒置顯微鏡(重慶光電儀器總公司，XDS-1B)，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204)，家用微波爐(順德惠而浦蜆華微波爐制品有限公司，KS2183)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械三廠，H.H.S)，恒溫培養(yǎng)箱(南京實(shí)驗(yàn)儀器廠，000984-09-0)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，DGG-9240BD)，臺(tái)式滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，TMQ.CV/5070)。

1.2主要試劑：RPMI.1640培養(yǎng)液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：12081705)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：120509)，青-鏈霉素(gibco by life technologies，批號(hào)：1116255)，消化酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：12060701)，瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20080802)，中性紅(天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心，批號(hào)：20050428)，PBS(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)：12082903)，DPBS(M&C Gene Technology，批號(hào)：A0612110)，苯酚(天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110326)，吸收性醫(yī)用明膠海綿(金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠，批號(hào)：121004)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞：健康、初成年的同一遠(yuǎn)交系雄性白化豚鼠15只，體重300～500g，由吉林市昌邑區(qū)左家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(吉)2009-0001。健康、初成年的同一品系雄性白化兔3只，體重分別為2.2 kg，2.3 kg和2.5 kg，由哈藥集團(tuán)中藥二廠提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(黑)2012-002。ATCC CCL1[NCTC clone 929(小鼠成纖維細(xì)胞)]由中科院提供。

1.4方法：按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)[1-3]。

1.4.1 遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗(yàn)。①試驗(yàn)樣品制備：試驗(yàn)樣品：剪成2.5 cm×2.5 cm尺寸敷貼片，直接用于試驗(yàn)。陰性對(duì)照：將濾紙剪成2.5 cm×2.5 cm尺寸并用氯化鈉注射液浸透，作為陰性對(duì)照樣品敷貼片。②試驗(yàn)步驟：將15只豚鼠分為兩組，其中試驗(yàn)樣品組10只豚鼠，陰性對(duì)照組5只豚鼠。誘導(dǎo)階段：將試驗(yàn)樣品和陰性對(duì)照分別局部貼敷于豚鼠左上背部除毛部位，再用封閉性包扎帶固定6 h，6 h后除去封閉包扎帶和敷貼片。1周中連續(xù)3 d重復(fù)該步驟，連續(xù)3周。激發(fā)階段：最后一次誘導(dǎo)貼敷后14 d，用試驗(yàn)樣品對(duì)試驗(yàn)樣品組和對(duì)照組全部豚鼠進(jìn)行激發(fā)。將試驗(yàn)樣品貼敷于每只豚鼠的右下腹側(cè)去毛部位，6 h后除去固定器、封閉包扎帶和敷貼片。

1.4.2皮膚刺激試驗(yàn)。①試驗(yàn)樣品制備：同遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗(yàn)。②試驗(yàn)步驟：選擇體重大于2 kg同一品系健康白化兔3只，于實(shí)驗(yàn)前24 h將家兔背部被毛除去(約10 cm×15 cm區(qū)域)，作為試驗(yàn)和觀察部位。單次接觸試驗(yàn)：在家兔背部左前側(cè)和右后側(cè)貼敷試驗(yàn)樣品，在家兔背部右前側(cè)和右后側(cè)貼敷陰性對(duì)照，用紗布覆蓋敷貼片部位，并用包扎帶固定4 h。多次接觸試驗(yàn)：?jiǎn)未谓佑|試驗(yàn)完成72 h后進(jìn)行，試驗(yàn)方法同單次接觸試驗(yàn)，連續(xù)實(shí)驗(yàn)12d。

1.4.3細(xì)胞毒性試驗(yàn)(瓊脂擴(kuò)散法)。①試驗(yàn)樣品制備：試驗(yàn)樣品：將透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼制成直徑約5 mm的圓片；陰性對(duì)照：將高密度聚乙烯制成直徑約為5 mm，厚約2 mm的圓片；陽(yáng)性對(duì)照：將醫(yī)用明膠海綿制成直徑約為5 mm的圓片，并用20%的苯酚溶液將其浸透。②試驗(yàn)步驟：選擇復(fù)蘇傳至第4代的細(xì)胞再傳代后培養(yǎng)48h，消化及稀釋?zhuān)辜?xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL。取6個(gè)培養(yǎng)皿，每皿加10 mL細(xì)胞懸液，放入CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。將制備好的2×瓊脂加熱融化后冷卻到48 ℃，與預(yù)熱至48 ℃的2×培養(yǎng)液以1∶1混勻后，倒入上述棄去原培養(yǎng)液的6個(gè)培養(yǎng)皿中，每皿10 mL。待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，每皿加入10 mL 0.01%中性紅染色液并在暗處保存20 min。將制備好的樣品放入培養(yǎng)皿中，供試品，陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組各為2皿，每皿放置2個(gè)樣品，放入CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h。

2結(jié)果

2.1遲發(fā)型超敏反應(yīng)封閉貼敷試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)Magnusson和Kligman分級(jí)，敷貼試驗(yàn)反應(yīng)為無(wú)明顯改變，為0級(jí)；散發(fā)性或斑點(diǎn)狀紅斑，為1級(jí)；中度融合性紅斑，為2級(jí)；重度紅斑和水腫，為3級(jí)。

除去激發(fā)敷貼片后48 h進(jìn)行評(píng)分，試驗(yàn)樣品組和陰性對(duì)照組豚鼠激發(fā)部位均無(wú)明顯改變，根據(jù)上述分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，兩組等級(jí)均為0級(jí)。

2.2皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)皮膚反應(yīng)積分系統(tǒng)，通過(guò)反應(yīng)的紅斑和結(jié)痂形成、水腫形成對(duì)原發(fā)性刺激計(jì)分，刺激最高計(jì)8分。

紅斑和結(jié)痂形成為無(wú)紅斑，計(jì)0分；極輕微紅斑(勉強(qiáng)可見(jiàn))，計(jì)1分；清晰紅斑，計(jì)2分；中度紅斑，計(jì)3分；重度紅斑(紫紅色)至焦痂形成，計(jì)4分。

水腫形成為無(wú)水腫，計(jì)0分；極輕微水腫(勉強(qiáng)可見(jiàn))，計(jì)1分；清晰水腫(腫起，不超出區(qū)域邊緣)，計(jì)2分；中度水腫(腫起約1 mm)，計(jì)3分；重度水腫(腫起超過(guò)1 mm，并超出接觸區(qū))，計(jì)4分。

單次接觸試驗(yàn)后24 h、48 h、72 h，3只家兔皮膚反應(yīng)均未出現(xiàn)紅斑和水腫。多次接觸試驗(yàn)每次在除去敷貼片后1 h以及再次接觸前和末次接觸后的1 h、24 h、48 h、72 h，3只家兔皮膚反應(yīng)均未出現(xiàn)紅斑和水腫。

2.3細(xì)胞毒性試驗(yàn)(瓊脂擴(kuò)散法)結(jié)果：根據(jù)褪色指數(shù)及溶解指數(shù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，利用顯微鏡觀察褪色指數(shù)和溶解指數(shù)。

顯微鏡觀察未發(fā)現(xiàn)褪色，褪色指數(shù)為0；只有試樣下方褪色，褪色指數(shù)為1；褪色邊緣距試樣邊緣小于 5.0 mm，褪色指數(shù)為2；褪色邊緣距試樣邊緣在5～10.0 mm內(nèi)，褪色指數(shù)為3；褪色邊緣距試樣邊緣大于 10.0 mm，褪色指數(shù)為4；整個(gè)培養(yǎng)區(qū)褪色，褪色指數(shù)為5。

顯微鏡觀察未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞溶解，溶解指數(shù)為0；細(xì)胞溶解小于20%，溶解指數(shù)為1；細(xì)胞溶解在20%～40%內(nèi)，溶解指數(shù)為2；細(xì)胞溶解在 40%～60%內(nèi)，溶解指數(shù)為3；細(xì)胞溶解在60%～80%內(nèi)，溶解指數(shù)為4；細(xì)胞溶解大于80%，溶解指數(shù)為5。

根據(jù)細(xì)胞毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞反應(yīng)=褪色指數(shù)/溶解指數(shù)。細(xì)胞反應(yīng)為0/0，0級(jí)，試驗(yàn)樣品無(wú)細(xì)胞毒性；細(xì)胞反應(yīng)為1/1，1級(jí)，試驗(yàn)樣品有輕度細(xì)胞毒性；細(xì)胞反應(yīng)為2/2至3/3，2級(jí)，試驗(yàn)樣品有中度細(xì)胞毒性；細(xì)胞反應(yīng)為4/4至5/5，3級(jí)，試驗(yàn)樣品有重度細(xì)胞毒性。

供試品組四個(gè)敷貼片均未發(fā)現(xiàn)褪色，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞溶解，細(xì)胞反應(yīng)為0/0，0級(jí)，無(wú)細(xì)胞毒性。陰性對(duì)照組四個(gè)敷貼片均未發(fā)現(xiàn)褪色，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞溶解，細(xì)胞反應(yīng)為0/0，0級(jí)，無(wú)細(xì)胞毒性。陽(yáng)性對(duì)照組四個(gè)敷貼片褪色邊緣距試樣邊緣7 mm，細(xì)胞溶解為50%，細(xì)胞反應(yīng)為3/3，0級(jí)，中度細(xì)胞毒性。

3討論

透明質(zhì)酸鈉是透明質(zhì)酸的鈉鹽形式，它具有保濕性、潤(rùn)滑性、生物相容性、生物可降解性、細(xì)胞流動(dòng)性和細(xì)胞附著等功能[4]。對(duì)其深加工制成的醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉凝膠被廣泛用于眼科手術(shù)，防治外傷性或退變性骨關(guān)節(jié)炎，外科手術(shù)等。醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼作為一種新型生物材料，在安全性評(píng)價(jià)方面未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)皮膚致敏試驗(yàn)，皮膚刺激試驗(yàn)，細(xì)胞毒試驗(yàn)三種試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)，醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉修復(fù)貼作為醫(yī)療器械使用是安全的。

參考文獻(xiàn)

[1]GB/T 16886.10-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)[S].

[2]GB/T 16886.5-2003醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)[S].

[3]GB/T 16886.2-2011醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2部分：動(dòng)物福利要求[S].

[4]畢瑩，何文龍，李杰新.醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉運(yùn)動(dòng)粘度的相關(guān)因素試驗(yàn)[J].青島大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，17(1)：1-4.

[中圖分類(lèi)號(hào)]R986

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A學(xué)科分類(lèi)代碼：35099

收稿日期：2015-08-07

Biological Tests of Medical Sodium Hyaluronate Repair Paste

Wang ZongweiXiao JiayinLi Qingzhong

(Heilongjiang Institute for Food and Drag Control，Harbin 150001，China)

AbstractObjectiveObserving medical sodium hyaluronate repair paste on experimental animal skin sensitization, skin irritation and cytotoxicity, providing scientific basis to evaluate the biological safety of medical uses as its. MethodsOn the basis of the product and the human body contact and contact time, according to the standards of biological evaluation of medical devices of skin sensitization test, skin irritation test, evaluate the bio safety of cell toxicity test.ResultsNo skin sensitization and skin irritation, no cell toxicity. Conclusionmedical sodium hyaluronate repair with clinical for mitigation and compensation injury is safe to use.

Key wordsMedical sodium hyaluronate repair paste；Medical apparatus；Biological safety evaluation