唐恩奇，李 濱，蔣歡歡, 汪麗燕

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 桂林 541001

構(gòu)造肝癌動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

唐恩奇，李 濱，蔣歡歡, 汪麗燕

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 桂林 541001

肝癌模型的構(gòu)造是學(xué)者研究肝癌的發(fā)病機(jī)制、臨床診斷以及治療預(yù)后的重要一步。動(dòng)物模型構(gòu)造的效果直接影響了對(duì)肝癌的研究進(jìn)展。近年來(lái)，學(xué)者對(duì)肝癌動(dòng)物模型的構(gòu)造有越來(lái)越多的探索，并且取得了很大的進(jìn)展。本文探討多種肝癌動(dòng)物模型的構(gòu)造方法，比較各種造模方法的利弊。

肝腫瘤；動(dòng)物模型；二乙基亞硝胺；黃曲霉毒素B1

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是人類(lèi)最常見(jiàn)的腫瘤之一，病死率極高。制備良好的肝癌動(dòng)物模型是人類(lèi)對(duì)肝癌進(jìn)行研究的重要前提條件。目前，肝癌動(dòng)物模型的構(gòu)造有多種方法，其中最常見(jiàn)的是誘發(fā)性肝癌模型，其次是移植性肝癌模型，而自發(fā)性肝癌模型因制備成功率較低及制備時(shí)間較長(zhǎng)等因素，一般不為研究采用。

1 誘發(fā)性肝癌動(dòng)物模型

誘發(fā)性動(dòng)物模型主要是指運(yùn)用化學(xué)、物理或生物致癌因素作用于動(dòng)物，使動(dòng)物自然發(fā)生肝癌。其中因化學(xué)致癌因素可控性大而通常被使用。下面介紹常用的化學(xué)物質(zhì)誘癌方法。

1.1 二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)肝癌模型

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇：應(yīng)選用健康純系大鼠，常用品種有Wistar、SD大鼠。大鼠的性別和年齡對(duì)誘癌率高低有直接關(guān)系。一般認(rèn)為雄性大鼠比雌性大鼠的成功率高。選用幼年大鼠，質(zhì)量控制在200～250 g。

1.1.2 給藥途徑：常見(jiàn)的給藥途徑有2種，分別為口服給藥和注射給藥。兩者各有利弊，前者易受個(gè)體差異造成飲水量的差異，但操作較簡(jiǎn)單安全，可控性高。后者一般選用腹腔注射，優(yōu)點(diǎn)是可以嚴(yán)格控制劑量，減少個(gè)體之間給藥的計(jì)量誤差，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，易因大鼠的反抗影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.1.3 給藥方案：(1)實(shí)驗(yàn)組以含DEN 80 ppm濃度飲水, 連續(xù)12周后改為自由飲水。誘癌率為70.6%[1]。(2)實(shí)驗(yàn)組大鼠給予DEN 100 mg/kg腹腔注射后輔以N-亞硝基嗎啉80 ppm自由飲水，16周后誘癌成功[2]。(3)Solt-Farbe誘癌模型的方法[3]：實(shí)驗(yàn)組大鼠第1天給予一次性腹腔注射DEN 200 mg/kg，2周后喂含有0.02%的2-乙酰氨基芴(2-AAF)飼料，持續(xù)喂2周，第3周末做2/3肝切除術(shù), 第4周末恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)飼料，該方法誘癌速度快,在第4周即可發(fā)現(xiàn)大鼠肝內(nèi)出現(xiàn)大量變異肝細(xì)胞灶。(4)實(shí)驗(yàn)組大鼠每日給予30 μg/ml DEN飲用水，自由飲用22周[4]。(5)實(shí)驗(yàn)組大鼠前3周腹腔注射DEN 50 mg/kg， 2次/周，至第4～6周改為1次/周，停藥至第11周，恢復(fù)原劑量1次/周注射至第13周，再停藥，約至19周誘癌成功[5]。(6)實(shí)驗(yàn)組大鼠給予腹腔注射5 mg/kg，連續(xù)注射6個(gè)月[6]。(7)實(shí)驗(yàn)組大鼠給予DEN皮下注射，每周2次，連續(xù)注射15周。在16～24周期間停止注射恢復(fù)正常飼養(yǎng)。25～40周，DEN以0.05 g/L的初始劑量和0.1 g/L的最終劑量加入飲用水中自由飲用。41～50周恢復(fù)正常飲用水[7]。

用DEN誘發(fā)肝癌模型特點(diǎn)為誘癌成功率較高,對(duì)肝臟較專(zhuān)一，肝細(xì)胞癌所占比例較大，是迄今應(yīng)用最廣泛的一種建造肝癌模型的方法[8]。值得提出的是，由于二乙基亞硝胺是劇毒藥物，在誘癌過(guò)程中，個(gè)別老鼠會(huì)因?yàn)椴荒苣褪芩幬锏亩拘远崆八劳?，所以?yīng)該注意觀察老鼠的精神狀態(tài)，食欲情況，有無(wú)豎毛、呼吸急促等癥狀。具體給藥方案應(yīng)該根據(jù)老鼠的綜合情況而做出適當(dāng)調(diào)整：減少藥物劑量或者停藥一段時(shí)間。不能盲目追求造模周期，應(yīng)該注意保證老鼠的生存率以便進(jìn)行后續(xù)研究。朱艷志等[9]在造模過(guò)程中采取了DEN間斷給藥方法，即在大鼠喂含0.01% DEN水期間根據(jù)大鼠的精神、飲食、糞便、毛色及活動(dòng)等一般情況設(shè)立間歇期，在間歇期內(nèi)喂正常水，此方法誘癌成功率高、大鼠存活率高。周倜等[10]按20 mg/kg給予DEN腹腔注射SD大鼠，3次/周，至12周時(shí)停藥，此方法采用間斷小劑量注射DEN，致癌率為76.2%，死亡率僅為 8%，大大降低了誘癌過(guò)程中大鼠的死亡率。

1.2 黃曲霉素(AFB1)誘發(fā)肝癌模型

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：同上述DEN誘發(fā)肝癌造模方法。

1.2.2 給藥途徑：多用腹腔注射、直接灌胃兩種。也有少數(shù)用經(jīng)口給藥法。

1.2.3 給藥方案：(1)實(shí)驗(yàn)組大鼠每日以200 μg/kg劑量AFB1灌胃至4周，誘癌率高達(dá)96%[11]。(2)有學(xué)者用AFB 10.75～1.5 g/kg一次性腹腔注射，2周后以含0.015%的2-AAF飼料飼養(yǎng)4周，可以建立AFB1致大鼠肝癌的短期模型[12]。(3)(4)實(shí)驗(yàn)組于第3周開(kāi)始以200 μg/kg腹腔注射AFB1，3次/周注射至第16周；第22～30周以100 μg/kg，2次/周注射；第35～45周以 100 μg/kg注射，每周1次[13]。(5)實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射100～200 μg/kg，每周1～3次。誘癌率達(dá)76%[14]。

用AFB1構(gòu)造肝癌模型誘癌周期較長(zhǎng)，一般需要1年時(shí)間以上。AFB1可誘發(fā)肝癌，但不能伴有嚴(yán)重的肝實(shí)質(zhì)損害、不能伴發(fā)肝硬化,癌變與肝小膽管增生并無(wú)明顯關(guān)系;在誘癌早期主要以變異灶為主,少見(jiàn)結(jié)節(jié)，中期開(kāi)始結(jié)節(jié)比例升高，中晚期以結(jié)節(jié)為主，晚期可見(jiàn)肝細(xì)胞癌和混合細(xì)胞癌[15]。

1.3 二甲基氨基偶氮苯(3′-Me-DAB)誘發(fā)肝癌模型

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：選擇健康的SD雄性大鼠。

1.3.2 給藥途徑：經(jīng)口給藥。

1.3.3 給藥方案：(1)用6%的3′-Me-DAB花生油溶液按2∶98比例與精制大米配成誘癌飼料進(jìn)行正常飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組每天喂10 g/只，早晚2次,每次5 g，喂養(yǎng)3個(gè)月后停藥改喂普通飼料[16]。(2)用0.06%濃度的3′-Me-DAB的飼料喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組大鼠，20周后誘癌成功[17]。

誘發(fā)性肝癌模型在建造過(guò)程中可以控制誘癌劑量和誘癌條件，誘癌結(jié)果多為肝細(xì)胞癌彌漫結(jié)節(jié)型，且合并肝硬化，較為接近于人肝癌的發(fā)病過(guò)程，且發(fā)病率和發(fā)病時(shí)間易于人為控制,結(jié)果重復(fù)性好。缺點(diǎn)是誘發(fā)時(shí)間一般較長(zhǎng),動(dòng)物喂養(yǎng)至少需要3～5個(gè)月或者更長(zhǎng)時(shí)間。

2 移植性肝癌動(dòng)物模型

移植性肝癌動(dòng)物模型是指用來(lái)源于動(dòng)物或人的肝癌組織或細(xì)胞移植到動(dòng)物體內(nèi)(肝臟、肝外組織或器官) 所形成肝癌動(dòng)物模型。人類(lèi)腫瘤移植瘤常來(lái)源于腫瘤活檢組織、手術(shù)切除標(biāo)本或人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系。目前國(guó)內(nèi)常用的移植性肝癌動(dòng)物模型有大鼠模型、小鼠模型及裸鼠模型。

2.1 Hep-G2細(xì)胞株建立裸鼠肝癌模型

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：多選擇裸鼠。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法：取培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞,濃度為6.0×106/ml。實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠在皮下注射0.2 ml細(xì)胞懸液[18]。

2.2 移植性大鼠肝癌模型

2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇：Wistar大鼠或SD成年雄性大鼠。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法:(1)皮下種植：取1 ml癌細(xì)胞懸液注射于Wistar大鼠肋腹皮下。接種后6～9 d皮下即可摸到黃豆般大的瘤塊，呈圓形或橢圓形，逐漸增大，晚期腫瘤平均直徑3.4 cm。皮下移植常因腫瘤淺在及局限，便于觀測(cè)而被采用。但此模型的缺點(diǎn)是具有較高的自發(fā)消退率[19]。(2)腹腔種植：可取原發(fā)灶肝癌組織制成細(xì)胞懸液，注射于Wistar大鼠腹腔內(nèi)。該方法移植成功率高，但因?yàn)槟[瘤的生長(zhǎng)部位深且不局限，不便于研究。(3)肝內(nèi)接種：SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。SD大鼠以2%的戊巴比妥鈉0.4 ml腹腔注射麻醉消毒后,劍突下沿正中線剪開(kāi)腹壁2 cm后暴露肝左葉，實(shí)驗(yàn)組大鼠用注射器與肝表面呈約30～45°接種Walker-256細(xì)胞質(zhì);對(duì)照組則注射相同劑量的生理鹽水[20]。

動(dòng)物肝癌模型的建立具有多種方法，在研究過(guò)程中造模的具體方法的選擇應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒅芷诘榷喾矫娴囊蛩鼐C合考慮。選擇合適的肝癌模型不僅能為研究提供良好的研究條件還能促進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的產(chǎn)生，是肝癌相關(guān)研究中最初始也是至關(guān)重要的一步。提高誘癌率、降低誘癌動(dòng)物的死亡率將能為肝癌的臨床研究提供更理想的動(dòng)物模型。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Research progress of animal models of hepatocellular carcinoma

TANG Enqi, LI Bin, JIANG Huanhuan, WANG Liyan

Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China

Establishment of hepatocellular carcinoma models is important for studies on pathogenesis, diagnosis and clinical treatment of hepatocellular carcinoma. The effect of establishing models will influence the study of hepatocellular carcinoma. Recent years, more and more scholars have discussed how to create hepatocellular carcinoma models and have made great progress.In this article, various methods of establishing models were discussed and the differences among those methods were compared.

Hepatocellular carcinoma; Animal models; Diethylnitrosamine; Aflatoxin B1

廣西教育廳科研基金資助項(xiàng)目(2013YB155)

唐恩奇，在讀碩士研究生，研究方向：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與消化系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。E-mail: 747676379@qq.com

汪麗燕，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與消化系腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。E-mail: 168wangliyan@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.08.004

R735.7

A

1006-5709(2016)08-0857-03

2016-03-17