吳亞召，雷 萍，張文雋，杜 芳

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

桑黃黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化*

吳亞召，雷 萍**，張文雋，杜 芳

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

研究了不同碳源、氮源對桑黃（Phellinus linteus）液體培養(yǎng)中胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量的影響。通過單因素試驗篩選出最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為黃豆粉；利用L9(34)正交試驗，初步篩選出了桑黃胞內(nèi)黃酮液體發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為玉米粉2.0%、葡萄糖1.5%、黃豆粉1.0%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、VB110mg/100mL。

桑黃黃酮；液體發(fā)酵；碳源；氮源；培養(yǎng)基優(yōu)化

桑黃（Phellinus linteus），又稱桑臣、桑耳、桑黃菇等。分類學(xué)上屬擔子菌亞門（Basidionmycota）層菌綱（Hymenomycetes） 多孔菌目（Polyporales）木層孔菌屬（Phellinus），是大型珍稀藥用真菌[1]。《中藥大辭典》記載，桑黃可治血崩、血淋、帶下、閉經(jīng)等婦科疾病[2]?！侗静菥V目》記載桑黃能“利五臟，宣腸胃氣，排毒氣”。近年來研究報道桑黃具有的藥物作用歸納起來有以下7種：抗腫瘤作用；護肝作用，抗肝纖維化，促進肝細胞再生，可用于防治慢性肝炎、肝硬化、肝腹水等；降低和調(diào)整血糖濃度，有效預(yù)防及改善糖尿病；降低血脂，防止動脈硬化，防止心腦血管病的發(fā)生；預(yù)防和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；桑黃提取物能夠完全抑制尿酸，對痛風(fēng)有良好效果；抗過敏，對過敏性鼻炎、久治不愈的濕疹療效很好。據(jù)分析，桑黃的成分極其復(fù)雜，其主要活性成分為多糖、黃酮、三萜類等[3]。由于桑黃抗癌作用的主要成份是多糖，國內(nèi)外對桑黃的研究目前主要集中在液體發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖、多糖提取純化、結(jié)構(gòu)組成及藥理研究，研究其他活性成分的報道較少。

黃酮類化合物是一種廣泛存在于高等植物中的多酚類天然產(chǎn)物，研究表明黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、消炎、提高免疫力等作用[4]，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。桑黃由于環(huán)境條件制約以及自身生理生態(tài)特殊性，野生的子實體稀少，人工栽培還沒有達到真正意義上的產(chǎn)量，無法滿足市場對大量子實體的需求。檢測數(shù)據(jù)表明，桑黃菌絲體與子實體活性成分接近，且菌絲體提取物同樣具有抗腫瘤、抗氧化等功效[5]。因此，獲得桑黃及其活性成分以滿足醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)品需求，需采用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)對桑黃進行工業(yè)化、規(guī)模化深層發(fā)酵。本項研究以菌絲體胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量為主要指標，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化桑黃黃酮發(fā)酵培養(yǎng)基，以期為規(guī)?；a(chǎn)桑黃黃酮類活性物質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 菌株

桑黃菌種來自于陜西省微生物研究所微生物資源中心第三研究室，經(jīng)分子鑒定為裂蹄木層孔菌（Phellinus linteus）[6]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

采用綜合PDA培養(yǎng)基。

1.2.2 碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖1.5%、蛋白胨1.0%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、VB110 mg/100mL，pH自然。

1.2.3 氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基

蛋白胨1.0%、葡萄糖1.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、VB110 mg/100mL，pH自然。

1.2.4 試驗培養(yǎng)基

將碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖分別以蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、玉米粉取代，進行碳源試驗；將氮源測定基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨分別以酵母膏、麩皮、硝酸銨、黃豆粉、尿素、牛肉膏代替進行氮源試驗。

1.2.5 優(yōu)化培養(yǎng)基

在篩選出的碳源、氮源種類基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交試驗的方法，對桑黃黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

2 方法

2.1 一級種制備方法

配制綜合PDA培養(yǎng)基，高壓滅菌后制作斜面，在無菌條件下接種桑黃菌菌種塊0.3 cm2，28℃恒溫培養(yǎng)至長滿斜面，得到一級種備用。

2.2 液體培養(yǎng)基制備方法

按各種試驗配方配制培養(yǎng)基，定容后分裝于300 mL三角瓶中，每瓶裝液100 mL，8層紗布封口，121℃高壓滅菌30 min。

2.3 碳源篩選試驗

取一級桑黃菌菌種塊0.5 cm2，分別接種于7種不同碳源培養(yǎng)基中，溫度為（27±1）℃，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7 d，每次試驗重復(fù)3次。

2.4 氮源篩選試驗

取一級桑黃菌菌種塊0.5 cm2，分別接種于7種不同氮源培養(yǎng)基中，溫度為（27±1）℃、轉(zhuǎn)速為150 r·min-1條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7 d，每次試驗重復(fù)3次。

2.5 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)碳源、氮源單因素篩選試驗結(jié)果，以玉米粉（A） 和葡萄糖（B） 作為復(fù)合碳源，黃豆粉（C）、蛋白胨和酵母膏（D）作為復(fù)合氮源，各處理添加KH2PO40.2%、MgSO40.05%、VB110 mg/100mL，pH自然。取一級桑黃菌菌種塊0.5 cm2，分別接種于9種不同的正交試驗培養(yǎng)基中，于溫度（27±1）℃，轉(zhuǎn)速150 r·min-1條件下?lián)u瓶培養(yǎng)7 d，每次試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。試驗因素及其各水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗的因素及水平Tab.1 Factors and levels in L9(34)orthogonal test

2.6 菌絲體產(chǎn)量測定

用4層紗布過濾發(fā)酵液，并用蒸餾水沖洗菌絲體3次～5次，于68℃烘干至恒重，稱量。

2.7 黃酮產(chǎn)量測定

準確稱取桑黃菌絲體粉末0.5 g，加入60%乙醇15 mL，于70℃恒溫水浴提取2 h，流水冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，過濾。采用AlCl3比色法，以蘆丁為標準品測定黃酮含量，并按公式計算黃酮產(chǎn)量（Y），公式為：

式中：M表示黃酮含量；Y1表示菌絲體產(chǎn)量。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Excel進行統(tǒng)計分析，多組比較，新復(fù)極差檢驗法。

3 結(jié)果與分析

3.1 碳源篩選結(jié)果

不同碳源對桑黃發(fā)酵的影響見表2。

表2 不同碳源對桑黃發(fā)酵的影響Tab.2 Effect of various carbon sources on Phellinus igniarius fermentation

由表2可以看出，桑黃菌對培養(yǎng)基中不同碳源的利用有明顯差異，培養(yǎng)基中添加碳源種類對桑黃菌絲體生物量的影響依次為玉米粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、可溶性淀粉，對胞內(nèi)黃酮的影響依次為葡萄糖、玉米粉、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖?？梢姡煌荚捶N類對菌絲干重和胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量的影響大小不同，玉米粉為碳源時菌絲體干重高于葡萄糖，但胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量卻低于葡萄糖。因此，以胞內(nèi)黃酮為目標產(chǎn)物時，葡萄糖為最佳碳源，玉米粉次之。

3.2 氮源篩選結(jié)果

不同氮源對桑黃發(fā)酵的影響見表3。

由表3可以看出，培養(yǎng)基中添加不同氮源，桑黃菌對其的利用有明顯差異，添加氮源種類對桑黃菌絲體干重的影響依次為黃豆粉＞麩皮＞蛋白胨＞酵母膏＞牛肉膏＞硝酸銨＞尿素，對胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量的影響依次為黃豆粉＞蛋白胨＞酵母膏＞麩皮＞硝酸銨＞牛肉膏＞尿素?？梢?，不同氮源種類對菌絲體干重和胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量的影響大小不同，黃豆粉為氮源時菌絲體干重和胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量均很高；蛋白胨和麩皮相比較，麩皮作為氮源時菌絲體干重高于蛋白胨，但胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量卻低于蛋白胨。因此，以胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量為目標產(chǎn)物時，黃豆粉為最佳氮源，蛋白胨次之。

表3 不同氮源對桑黃發(fā)酵的影響Tab.3 Effect of various nitrogen sources on Phellinus igniarius fermentation

3.3 正交試驗優(yōu)化桑黃黃酮液體培養(yǎng)基的結(jié)果與直觀分析

L9(34)正交試驗結(jié)果直觀分析見表4。從表4可以看出正交試驗最優(yōu)組合為A1B2C2D2。各因素的最優(yōu)水平為A1B2C2D3，從R值可以看出D因素對結(jié)

表4 L9(34)正交試驗結(jié)果直觀分析表Tab.4 Intuitive analysis table for the result of L9(34)orthogonaltest

果的影響最小，且D2與D3相差只有1%?？紤]成本選擇正交試驗最優(yōu)組合，即優(yōu)化后的桑黃黃酮液體發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉2.0%、葡萄糖1.5%、黃豆粉1.0%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、VB110mg/100mL。

4 討論

通過單因素篩選試驗發(fā)現(xiàn)，桑黃胞內(nèi)黃酮液體發(fā)酵最適碳源是葡萄糖，其次為玉米粉；最適發(fā)酵用氮源為黃豆粉，其次為蛋白胨。采用L9(34)正交試驗優(yōu)化后結(jié)果表明，桑黃胞內(nèi)黃酮更適合于在復(fù)合碳氮源培養(yǎng)基中生長，胞內(nèi)黃酮產(chǎn)量高。最佳發(fā)酵液體培養(yǎng)基為玉米粉1%、葡萄糖2%、黃豆粉1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、VB110mg/100mL。

[1]戴玉成.藥用擔子菌——鮑氏層孔菌（桑黃）的新認識[J].中草藥，2003，34（1）：94-95.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1995.

[3]鄭立軍，王清，季俊虬，等.藥用真菌桑黃的研究進展[J].現(xiàn)代中藥研究與實驗，2005，19（3）：60-64.

[4]王曉梅，曹穩(wěn)根.黃酮類化合物藥理作用的研究進展[J].宿州學(xué)院學(xué)報，2007，22（1）：105-107.

[5]Nakamura T,Akiyama Y,Matsugo S,et al.Purification of caffeic acid as an antioxidant from submerged culture mycelia of Phellinus linteus(Berk.et Curtis)Teng(Aphyllophoromycetideae)[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2003 (5):165-169.

Optimization of Liquid Medium for Fermenting Flavones from Phellinus linteus

WU Ya-zhao,LEI Ping,ZHANG Wen-jun,DU Fang
(Shaanxi Microbiology Research Institute,Xi’an 710043,China)

The effect of different carbon sources,nitrogen sources on the production of intracellular flavone in liquid culture of Phellinus linteus has been studied.The optimum carbon and nitrogen source has been determined by performing single factor experiment.The result shows that the optimum carbon source is glucose,and the optimum nitrogen source is soybean meal.Using L9(34)orthogonal test,the optimum medium of liquid fermentation for intracellular flavonoids from P.igniarius optimization is corn flour 2.0%,glucose 1.5%,soybean meal 1%,peptone 1%,yeast extract 0.5%,KH2PO40.2%,MgSO40.05%,VB110 mg/100mL.

flavones from Phellinus linteus;liquid fermentation;carbon source;nitrogen source;optiminzation of medium

S646.9

A

1003-8310（2016）05-0021-04

10.13629/j.cnki.53－1054.2016.05.006

*項目來源：陜西省科學(xué)院應(yīng)用基礎(chǔ)與產(chǎn)業(yè)化項目（2014K－14）。

吳亞召（1962－），男，本科，副研究員，主要從事食（藥）用菌研究。E－mail:wuyazhaonstl＠sina.com

**通信作者：雷萍（1966－），女，本科，副研究員，主要從事珍稀食（藥）用菌研究。E－mail:wuleiping2529＠126.com

2016－07－11