王卿惠，徐興軍，邵淑麗，田金波，張偉偉，王有祥，薛明強(qiáng)

（齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

動物胰蛋白酶的純化、性質(zhì)及其固定化研究進(jìn)展

王卿惠，徐興軍，邵淑麗，田金波，張偉偉，王有祥，薛明強(qiáng)

（齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

根據(jù)近年國內(nèi)外胰蛋白酶最新研究報(bào)道，綜述了動物胰蛋白酶的研究進(jìn)展，包括酶的純化、特性以及酶的固定化，以期為胰腺蛋白酶的研究、開發(fā)和利用提供一定的參考.

動物；胰蛋白酶；純化；固定化

胰蛋白酶（trypsin，EC3.4.21.4）廣泛應(yīng)用于輕工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、食品加工業(yè)、畜牧業(yè)和現(xiàn)代生物技術(shù)等領(lǐng)域，日益成為研究熱點(diǎn).作為絲氨酸蛋白酶家族的成員之一，胰蛋白酶激活前常以酶原前體形式存在.胰蛋白酶原前體[1]含有一段由15個氨基酸組成的信號肽序列和一個由6～8個氨基酸組成的激活肽（TAP）序列.若信號肽序列被結(jié)合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的信號肽酶切除，則胰蛋白酶原前體轉(zhuǎn)變成胰蛋白酶原；若其中的激活肽序列再被腸肽酶水解掉，最后轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘囊鹊鞍酌?胰蛋白酶屬于內(nèi)肽酶，主要水解Arg或Lys賴氨酸羧基端的具有高度專一性的肽鍵.胰蛋白酶具有“雙重”作用，它不僅可以消化普通蛋白質(zhì)，還可以激活胰腺分泌的其它酶原[2]，在蛋白質(zhì)水解方面發(fā)揮重要的作用.大多數(shù)脊椎動物體內(nèi)的胰蛋白酶以上述形式被活化，而對于在無脊椎動物（如昆蟲及甲殼動物），其激活機(jī)制可能是“自我活化”[3].但Buettner K[4]研究發(fā)現(xiàn)，人類胰蛋白酶原的激活也存在“自我活化”現(xiàn)象.

1 胰蛋白酶活性測定

1.1 胰蛋白酶催化特點(diǎn)

胰蛋白酶一般存在于高等動物胰液和低等動物胃液中，也廣泛存在于鳥類的肝臟、胰腺和腸道內(nèi).其催化特點(diǎn)為：（1）無需提供能量；（2）有高度的專一性；（3）底物與酶的活性中心結(jié)合是可逆的，這種結(jié)合使得蛋白質(zhì)特定肽鍵因彎曲變形更易于受到水分子攻擊.

1.2 胰蛋白酶活性測定

由于胰蛋白酶不僅能催化由堿性氨基酸（Arg，Lys）的羧基與其它氨基酸的氨基形成的肽鍵，還能催化由堿性氨基酸的羧基形成的酰胺鍵或酯鍵.因此，若以含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物，便可通過測定產(chǎn)物的變化來測定胰蛋白酶的活力.目前常用的底物包括苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺（BAPA，NAPNA）、苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（BANA）、苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）以及對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（TAME）.以BAEE為底物，在253 nm下測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值變化，一般吸光值每升高0.001即為一個胰蛋白酶酶活單位（1 μmol/min）.張東裔[5]等選用TAME作為底物，由于該底物受胰蛋白酶作用后轉(zhuǎn)變成對甲苯磺酞基精氨酸，使反應(yīng)混合物的pH值下降；以酚紅為指示劑，通過測定555 nm處光吸收值降低來監(jiān)測pH值變化，在0.001～0.3 μg范圍內(nèi)，胰蛋白酶含量與光吸收值降低呈線性關(guān)系，從而可以用光吸收值降低值表示胰蛋白酶的相對酶活力.朱忠勝[6]等對菲牛蛭（Poecilobdella）不同生長階段幼體組、亞成體和成體組及攝食前后的消化酶活性進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)亞成體組胰蛋白酶活力最強(qiáng).甘麗萍[7]等調(diào)查家蠶幼蟲（Bombyx mori）胰蛋白酶活性，探討了其與絲氨酸蛋白酶基因表達(dá)之間的關(guān)系.張建萍[8]等采用紫外線吸收法測定了塔里木兔（Lepus yarcandensis）和家兔（Oryctolagus curiculus）胰蛋白酶活力.結(jié)果表明，家兔胰腺和腸道胰蛋白酶活性高于塔里木兔.可見，胰蛋白酶活性的有效測定為研究動物生理和酶基因表達(dá)提供了前提條件.

福林酚試劑[9]在堿性條件下可以被酚類化合物還原為藍(lán)色物質(zhì)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物），由于蛋白質(zhì)含酚基氨基酸，因此可以利用此原理測定蛋白酶活力.

Dong M[10]最新采用7肽（CRRRRRR）底物建立一個簡單敏感的胰蛋白酶測定的電化學(xué)方法.在方波內(nèi)金屬釕電極的伏安電流增加與胰蛋白酶活性在0.004 7～0.052 0 μmol/min/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系.可見，測定胰蛋白酶的關(guān)鍵是選擇合適的底物，然后用胰蛋白酶催化，找出產(chǎn)物的變化規(guī)律與胰蛋白酶活性的相關(guān)性，用產(chǎn)物或產(chǎn)物引起的直接能測定的參數(shù)變化來表示胰蛋白酶的活性.

2 胰蛋白酶提取、純化和酶學(xué)性質(zhì)研究

2.1 胰蛋白酶提取

從動物胰臟中分離、提取胰蛋白酶時，一般需幾個連續(xù)的步驟：（1）用稀酸將酶原從胰腺細(xì)胞中抽提出來；（2）調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn)，去除酸性雜蛋白；（3）硫酸銨分級沉淀胰蛋白酶原；（4）酶原用極少量活性胰蛋白酶激活；（5）再次鹽析除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶；（6）收集胰蛋白酶組分獲得粗品.

2.2 胰蛋白酶純化

動物胰蛋白酶純化方法改進(jìn)的幾個實(shí)例見表1.

表1 動物胰蛋白酶純化方法改進(jìn)的幾個實(shí)例

由表1可見，為了獲得更純的酶，一般需要過色譜柱.在純化胰蛋白酶時，可以先活化后層析；也可以先層析后活化[11]41-42.為避免糜蛋白酶等非特異性酶切，常需要對胰蛋白酶進(jìn)行修飾[12].

表1在純化豬胰蛋白酶時使用了反相層析.所謂正相和反相主要是由固定相和流動相極性大小決定的.正相柱的固定相極性大于流動相，反相柱則相反.因此，正相柱是極性小的先出峰，反相柱是極性大的先出峰[13]79-80.DEAE-纖維素柱層析屬于陰離子交換層析，一般分離時堿性蛋白先出峰，酸性蛋白后出峰.苯甲脒類物質(zhì)是胰蛋白酶的廣譜抑制劑，苯甲脒類可以先偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠6B上，然后對胰蛋白酶樣品進(jìn)行純化.該方法流速高，非特異吸附少，填料粒度均勻，分離效果好，是純化胰蛋白酶最適合的填料[14]3-8.另外采用先凝膠過濾后離子交換方法的順序效果也很好[15]126-132.

2.3 胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)

胰蛋白酶純化方法的改進(jìn)有重要意義，高純度胰蛋白酶的獲得是研究其酶學(xué)性質(zhì)的關(guān)鍵.幾種魚類胰蛋白酶的純化、性質(zhì)及催化動力學(xué)研究見表2.比較Khangembam[14]8-12和Liu Chun-Hung[16]839-841研究的胰蛋白酶純化結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，純化的倍數(shù)越高，得率越小.因此，高純度酶的獲得是以“犧牲”胰蛋白酶為代價的.

表2 幾種魚類的胰蛋白酶的純化、性質(zhì)及催化動力學(xué)研究

水產(chǎn)魚類中胰蛋白酶分子量范圍一般在20～30 kDa之間.根據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)道，2種不同鱈魚（Gadus macrocephalus和Eleginus gracilis）的胰蛋白酶分子量均為24 kDa，與鮭點(diǎn)石斑魚的胰蛋白酶分子量一致.陳榮昌[19]等純化的2種青魚分子量分別為44 kD和43.5 kD.研究發(fā)現(xiàn)，EDTA對青魚胰蛋白酶的抑制作用很大，推測該酶可能為金屬蛋白酶.對于哺乳動物而言，胰蛋白酶分子量大小也在20～30 kDa范圍內(nèi)，如牛胰蛋白酶分子量為23.3 kDa，豬胰蛋白酶為24.0 kDa[20].相比之下，鳥類胰蛋白酶的分子量可能要大一些，如岑亮[21]等從鴨肝中獲得的胰蛋白酶相對分子量為35 kDa.

一般哺乳動物胰蛋白酶的最適溫度接近體溫，如丁凌霄[11]等研究的豬胰臟酶最適溫度為37 ℃.然而魚類的最適溫度比較高，在40～55 ℃之間.吳志強(qiáng)[22]研究表明，日本新糠蝦蛋胰蛋白酶最適反應(yīng)溫度為37 ℃，接近哺乳動物胰蛋白酶的最適溫度.魚類的最適pH值為7～10之間.但哺乳動物胰蛋白酶pI一般為8.0～9.0，屬于堿性蛋白酶；魚類胰蛋白酶的pI為4.5～6，屬于酸性蛋白酶.蝦類胰蛋白酶的pH值為2～6，酸性更加明顯.

在使用SDS-PAGE電泳對獲得的胰蛋白酶純品進(jìn)行初步驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，一般需要進(jìn)一步采用埃德曼反應(yīng)（Adman reaction）對蛋白質(zhì)的N-端進(jìn)行測序，從而更準(zhǔn)確地通過比對（blast）來鑒定所得胰蛋白酶與其它胰蛋白酶的親源關(guān)系.也可以對蛋白質(zhì)樣品作質(zhì)譜（MS）分析，通過獲得“小肽片段”對純化的胰蛋白酶加以鑒定.

從表2中可知，大多數(shù)胰蛋白酶的蛋白質(zhì)N-段都存在IVGG 4個氨基酸高度保守的序列，這可以作為鑒定胰蛋白酶的特異標(biāo)記序列.根據(jù)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，填加2 mM CaCl2保溫8 h能提高胰蛋白酶活力，可見Ca2+對胰蛋白酶有穩(wěn)定作用.Liu Chun-Hung[16]842-846等使用BAEE為底物，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶活性隨NaCl濃度（0～0.6 M）的增加而減小.Khaled[15]125-127使用BAPNA為底物，研究了金色小沙丁魚胰蛋白酶的動力學(xué).不同酶的Km值不同，同一種酶與不同底物反應(yīng)Km值也不同.因此，在計(jì)算Km值時，要考慮到所選擇的底物.Km值可近似反映出酶與底物親和力的大?。篕m值越大，表明酶與底物的親和力越小.結(jié)合表2可知，卡特拉魚（Catla Catla）胰蛋白酶對底物的親合最大（Km=0.062）.對于金色小沙丁魚（Sardinella aurita）的胰蛋白酶而言，盡管有3種同工酶亞型A，B，C，而且分子量、最適pH值和溫度都相同，但N-端氨基酸序列和動力學(xué)參數(shù)皆不相同，說明3種酶的催化效率不同.這可能是3種酶細(xì)微的氨基酸序列或種類不同所至.總之，在研究胰蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)時，不僅要研究酶的分子量、最適溫度、最適pH值以及酶的動力學(xué)參數(shù)變化，也要對酶的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，從而研究酶的構(gòu)效關(guān)系.

2.4 影響胰蛋白酶活性的因素

不同金屬離子以及不同的理化處理可以改變胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)和催化性質(zhì).

2.4.1 重金屬離子對胰蛋白酶的影響 金屬離子（如Cd2+，Al3+，Zn2+，Cu2+，Pb2+，Hg2+）可能是胰蛋白酶的抑制劑.研究金屬離子對酶的影響可使用多種技術(shù)和方法：（1）同步掃描熒光光譜技術(shù)（SFS）；（2）紫外可見吸收；（3）圓二色（CD）光譜法；（4）等溫滴定量熱法（ITC）；（5）酶活試驗(yàn)等.Zhang Tong[9]1805-1807等調(diào)查了Cu2+，Pb2+，Zn2+等離子對胰蛋白酶毒性產(chǎn)生的原因.研究發(fā)現(xiàn)，重金屬的毒性效應(yīng)應(yīng)歸于本身的特性而非所帶有的電荷.Zn2+對胰蛋白酶沒有明顯影響；Cu2+和Pb2+直接損傷酶的結(jié)構(gòu)和功能；Cu2+能夠和胰蛋白酶結(jié)合，從而導(dǎo)致胰蛋白酶的熒光淬滅并使其疏水性增加；高濃度的Pb2+也能改變胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)，減少胰蛋白酶的活性.同時發(fā)現(xiàn)，對胰蛋白酶活性的影響按Cu2+>Pb2+>Zn2+的順序逐漸減弱.等溫滴定量熱學(xué)分析表明，這些重金屬離子與胰蛋白酶之間的相互作用是自發(fā)的和放熱的，說明它們對胰蛋白酶具有抑制作用.

2.4.2 物理因素對胰蛋白酶的影響及原因 采用超高壓技術(shù)處理胰蛋白酶可以改變其空間結(jié)構(gòu)，從而可以研究酶空間結(jié)構(gòu)變化與酶活力之間的關(guān)系.對胰蛋白酶二級結(jié)構(gòu)變化的觀察可以采用傅立葉紅外光譜；對其三級結(jié)構(gòu)的變化研究可以采用熒光光譜；測定酶活性的變化可以使用福林酚法.劉平[23]等對超高壓（100～600 MPa）處理后的胰蛋白酶進(jìn)行了研究.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理的相比，超高壓對胰蛋白酶活力影響顯著.通過300 MPa處理，胰蛋白酶活力提高了0.386倍.此時胰蛋白酶的α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角的峰面積比值達(dá)到最大，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高.超聲波對胰蛋白酶也有影響.黃卓烈[24]等研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理使胰蛋白酶活力普遍升高，Km值變小，Vmax值也降低，酶對底物的親和力增大.

2.4.3 化學(xué)因素對胰蛋白酶的影響 張國文[25]等研究發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）通過氫鍵和范德華力與胰蛋白酶形成基態(tài)復(fù)合物而淬滅胰蛋白酶的內(nèi)源熒光.DBP與胰蛋白酶的結(jié)合使酶的α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量減少，使無規(guī)卷曲的含量增加，從而使蛋白質(zhì)聚集.分子模擬結(jié)果表明，DBP結(jié)合于胰蛋白酶S1疏水空腔附近，與氨基酸His57，Ser195和Gly193形成氫鍵，從而抑制了胰蛋白酶活性.吐溫（或聚山梨酯）為非離子型表面活性劑，是一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯.宋九華[26]等通過紫外和熒光光譜法研究了吐溫與牛胰蛋白酶之間的相互作用.研究發(fā)現(xiàn)，吐溫與牛胰蛋白酶主要表現(xiàn)為疏水作用力，對牛胰蛋白酶活性影響較少.但它們之間的相互作用能改變牛胰蛋白酶分子中的芳香族氨基酸殘基在酶空間結(jié)構(gòu)中所處的微環(huán)境，使微環(huán)境的疏水性增強(qiáng).吐溫對牛胰蛋白酶熒光淬滅效應(yīng)起因于牛胰蛋白酶與吐溫形成了復(fù)合物，能量轉(zhuǎn)移作用較小，屬于靜態(tài)淬滅.

3 胰蛋白酶的固定化研究

由于液相胰蛋白酶存在嚴(yán)重自溶、解折疊作用，限制了胰蛋白酶在生產(chǎn)上的直接應(yīng)用.而酶固定化技術(shù)能使胰蛋白酶穩(wěn)定性增加并可重復(fù)利用，從而為胰蛋白酶在生產(chǎn)上更廣泛地應(yīng)用開辟了道路.固定化酶就是采用理化方法，使酶與載體結(jié)合或把酶包埋在其中，形成凝膠或半透膜微囊體.固定化酶的制備方法有物理法和化學(xué)法兩大類，前者包括物理吸附法和包埋法等.安紅[27]等采用吸附法對胰蛋白酶在磁性核殼介孔分子篩（Fe3O4·MCM-41）上的固定化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與游離酶相比，固定化酶的耐溫區(qū)間和pH值適應(yīng)范圍明顯變寬，載體能保持良好介孔結(jié)構(gòu).孫俊[28]等通過靜電相互作用，將胰蛋白酶固定于羧甲基殼聚糖磁性納米顆粒（Fe3O4（PEG+CM-CTS））表面.結(jié)果表明，納米顆粒對胰蛋白酶的吸附符合Langmuir等溫吸附模型，載體對胰蛋白酶的最大固載量達(dá)117.6 mg/g，剩余的相對酶活性高達(dá)87.9％.固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性和較高的儲藏穩(wěn)定性.Maciel[29]經(jīng)Fe3+共沉淀以及采用聚苯胺將胰蛋白酶包裹合成磁性納米顆粒，平均直徑大約15 nm，以相對高自發(fā)磁化方式表現(xiàn)出磁化行為，主要以磁赤鐵礦（γFe2O3）形式存在.固定化胰蛋白酶活性進(jìn)一步提高，達(dá)到為原始活性的89％.化學(xué)法包括結(jié)合法和交聯(lián)法，結(jié)合法又分為離子結(jié)合法和共價結(jié)合法.阮貴華[30]等以多孔介質(zhì)材料Fe3O4·mSiO2·nSiO2為載體，采用γ-氨丙基三乙氧基硅烷接枝和戊二醛交聯(lián)方法對胰蛋白酶進(jìn)行了固定化.研究表明，φ（戊二醛）=1.875％，給酶量為0.3 mg/mL，反應(yīng)時間為4 h時酶的固定化效率可達(dá)50.5％，酶保留了77.3％的活性.Song X[31]使用靜電紡絲技術(shù)，將胰蛋白酶嵌入聚L-乳酸（PLLA）中，獲得活性納米纖維，可用于水解明膠.為改進(jìn)被聚L-乳酸納米纖維包合胰蛋白酶（NF-TR）穩(wěn)定性和酶催化效率，在纖維表面使用戊二醛將胰蛋白酶分子交聯(lián)起來形成（CL-TR）.在嚴(yán)峻的條件（50 ℃）下，CL-TR比NF-TR顯示了更好明膠水解能力，從而改善了CL-TR催化能力和穩(wěn)定性.胰蛋白酶被PLLA納米纖維表面交聯(lián)而固定，胰蛋白酶的變性、自溶和瀝濾受到抑制，從而使酶的性質(zhì)得到改善.LI Valuev[32]最新研究發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺水凝膠固定化胰蛋白酶活性依賴于水溶膠膨脹率、孔徑分布和酶結(jié)合方式.

影響胰蛋白酶固定化制備的因素很多，包括載體材料結(jié)構(gòu)和性能、固定化方法、位點(diǎn)和條件等，其中載體選擇和方法是固定酶制備的關(guān)鍵.酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復(fù)多次使用，便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動化生產(chǎn).固定化酶是近十余年發(fā)展起來的酶應(yīng)用技術(shù)，在工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有較好的應(yīng)用前景.但是活性降低，使用范圍減小，技術(shù)還有發(fā)展空間.

總之，采取各種有效的層析方法對胰蛋白酶進(jìn)行提取和純化，是研究胰蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ).在此基礎(chǔ)上，研究各種理化因素對胰蛋白酶的影響為深刻認(rèn)識胰蛋白酶結(jié)構(gòu)和功能的“構(gòu)效關(guān)系”提供了重要的科學(xué)數(shù)據(jù).胰蛋白酶的固定化是提高胰蛋白酶穩(wěn)定性的重要手段，將在工業(yè)上胰蛋白酶的開發(fā)和利用方面發(fā)揮重要作用，具有潛在的應(yīng)用價值.隨著固定化方法的改進(jìn)，必將獲得酶活性更高、穩(wěn)定性更好的固定化胰蛋白酶，并應(yīng)用于生產(chǎn)中以創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)價值.

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Recent research advances of the purification，properties and immobilization in animals trypsin

WANG Qing-hui，XU Xing-jun，SHAO SHU-li，TIAN Jin-bo，ZHANG Wei-wei，WANG You-xiang，XUE Ming-qiang

（School of Life Science and Agriculture and Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China）

According to the worldwide recent research reports on trypsin，reviewed the advances in animal trypsin，involving its purification，properties and immobilization，in order to provide some reference for the further study,exploitation and utilization of trypsin.

animal；trypsin；purification；immobilization；advances

Q955

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2016.12.011

2016-10-09

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（11541387；12511611）

王卿惠（1991-），女，山東肥城人，在讀碩士研究生，主要從事鳥類生理代謝方面的研究.E-mail：36018346@qq.com

徐興軍（1969-），男，黑龍江甘南人，教授，碩士，主要從事動物生理生態(tài)學(xué)方面的研究.E-mail：xxj0605@163.com

1007-9831（2016）12-0039-06