段星娥 楊紅潤

【摘要】目的 利用分子生物學(xué)方法研究云南省腸道病毒EV71基因序列特征。方法 采集患兒發(fā)病7天內(nèi)的糞便樣本，經(jīng)生物公司試劑盒驗證為EV71感染，設(shè)計合成8對引物擴(kuò)增合成，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后拼接，對拼接結(jié)果進(jìn)行分析，并與其他已發(fā)表的EV71全基因組序列進(jìn)行同源性對比；構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果 得到了云南省EV71全基因序列。結(jié)論 通過測序結(jié)果分析確定EV71病毒株與上海、北京、杭州EV71病毒株親緣關(guān)系最接近，同屬于C3亞型

【中圖分類號】R-1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1671-8801（2016）01-0181-02

手足口?。℉and foot mouth disease ， HFMD） 是嬰幼兒常見的傳染病，由腸道病毒引起，臨床上以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹、潰瘍等表現(xiàn)為主，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。

引起本病的腸道病毒有20 多種（型），均屬微小核糖核酸病毒科、人腸道病毒屬。其中柯薩奇病毒（Coxasckievirus） A16 型（CoxA16） 和腸道病毒71 型（ Enterovirus71，EV71） 最常見。有關(guān)EV71 感染的報道始于20 世紀(jì)70 年代初，1969 年EV71 型在美國被首次確認(rèn)。此后，EV71 感染與CA16 感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。2008年來全國多個省份暴發(fā)兒童手足口病，云南地區(qū)手足口病例數(shù)亦呈驟增趨勢，手足口病治療和預(yù)防任務(wù)十分艱巨，掌握云南地區(qū)兒童手足口病的病原體分子生物學(xué)資料刻不容緩。

一、材料與方法

1.1. 樣本采集

收集醫(yī)院手足口病患兒糞便樣本，于病人發(fā)病7天內(nèi)采集，5～8g/份，采集后立即放入無菌采便管保存。

1.2. 臨床樣本鑒定

采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）檢測臨床樣本，確定其為含有EV71病毒株。具體步驟參照試劑盒說明書。

1.3. RNA提取 采用離心柱法試劑盒提取，試劑盒購自北京天根，方法參考說明書進(jìn)行。

1.4. 引物設(shè)計與合成

參考NCBI發(fā)表的EV71病毒株（登錄號：HQ423143.1）以及Cox.A16病毒株（登錄號： HQ423141.1）序列設(shè)計引物。引物設(shè)計使用Primer Premier 5.0，引物質(zhì)量分析使用 Oligo 6.0。具體引物序列見表1。

1.5 . cDNA的合成利用試劑盒完成，試劑盒購自北京天根，方法參考說明書進(jìn)行。

1.6. RT-PCR反：利用試劑盒完成，試劑盒購自北京天根，方法參考說明書進(jìn)行。

1.7. 擴(kuò)增產(chǎn)物利用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（TIANGEN Midi Purification Kit），按說明書方法進(jìn)行片段的回收和純化?；厥胀旰笏蜕虾Ｉど锕こ逃邢薰緶y序，將得到的測序結(jié)果去載體序列后利用DANstar軟件進(jìn)行拼接。對拼接結(jié)果進(jìn)行序列分析。

二、結(jié)果

2.1. EV71測序結(jié)果

經(jīng)過測序、 序列拼接和分析，獲得EV71病毒株全基因組核苷酸序列（未包括多聚腺苷酸尾） 長度為 7416 bp， 其中A 占 27. 0% ， G 占 24.0%， C 占24. 4% ， T 占24 .6%，其中 A + T= 51. 6%含量豐富。5端非編碼區(qū)（ 5U TR） 長 753bp；病毒基因組編碼區(qū)全長 6 582 個核苷酸，編碼含2194個氨基酸殘基的多聚蛋白； 3端非編碼區(qū)末端長81 bp。

2.2. 氨基酸序列

根據(jù)拼接得到的EV71全基因組序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。具體結(jié)果見表2

本次測序得到的EV71病毒株基因組的特征和結(jié)構(gòu)符合腸道病毒，與EV71 國際標(biāo)準(zhǔn)株BrCr（ U22521）核苷酸同源性為80%， 氨基酸同源性為90.3%。

2.3. 進(jìn)化樹分析

用DNAstar中的 Megalign 軟件，對本次測序EV71 的VP1序列與取自 GenBank 的其它 EV71 毒株VP1序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果見下圖。

EV71為本次測序病毒株；HM002489為北京EV71病毒株；HQ891923、HQ891924上海EV71病毒株；FJ158601杭州EV71病毒株；EU703813安徽EV71病毒株；GU459070昆明 EV71病毒株；JF913464濟(jì)南EV71病毒株；JN001860寧波EV71病毒株；GQ892830南京EV71病毒株；AB550338日本東京EV71病毒株

三、討論

根據(jù)報道，EV 71 型的基因組為約含7 408 個核苷酸的單股正鏈 RNA， 基因組中僅有 1 個開放閱讀框（ ORF ） ， 編碼含 2 194 個氨基酸的多聚蛋白（ po lyprotein） ，在其兩側(cè)分別為5非編碼區(qū)（ UTR）和3 非編碼區(qū)。在3非編碼的末端含有1 個長度可變多聚腺苷酸尾（ polyA） ， 而其5 末端共價結(jié)合有1個小分子量蛋白（ VPg）。P1 區(qū)編碼外殼蛋白的前體蛋白，經(jīng)一系列的加工形成病毒外殼蛋白 V P1，VP2， VP3 及VP4。P2 和P3 區(qū)主要編碼蛋白水解酶及 RNA 聚合酶， 在進(jìn)化過程中高度保守。根據(jù)病毒衣殼蛋白VP1核苷酸序列的差異， 可將EV 71 分為A、 B、 C 共3 個基因型。A基因型只包含一個單獨的病毒株BrCr；B基因型可進(jìn)一步分為5個亞型，B1、B2、B3、B4、B5；C基因型也分為5個亞型，Cl、C2、C3、C4、C5。同一基因型內(nèi)，核營酸差異為12%，不同基因型之間核普酸的差異為16.5%-19.7%。本次所測的EV71病毒株與上海EV71病毒株（登錄號：HQ891923、HQ891924）、北京EV71病毒株（登錄號：HM002489）、杭州EV71病毒株（登錄號：FJ158601）等病毒株同源性>90%；VP1區(qū)與這些病毒株的VP1區(qū)核苷酸同源性均>98%。由此可知，不論從全基因組還是VP1區(qū)的進(jìn)化分析都表明本次測序得到的EV71病毒株屬于C3亞型。

參考文獻(xiàn)：

[1] 周世力， 李琳琳， 何雅青， 等. 我國分離的腸道病毒71 型（ SHZH03病毒株）全基因組核苷酸序列分析. 病毒學(xué)報， 2004，20： 7211.

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