李凡，吳琦，孫昕，李寬，張穎超，李雪，李玉，張秋陽，徐龍，陳懷永

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氣道上皮細胞緊密連接在小鼠哮喘中的病理學(xué)改變

李凡1，吳琦2△，孫昕2，李寬2，張穎超3，李雪2，李玉2，張秋陽2，徐龍2，陳懷永2

摘要：目的探討小鼠支氣管哮喘（哮喘）中氣道上皮緊密連接的病理學(xué)改變。方法10只小鼠隨機分為對照組和哮喘組，每組5只。哮喘組于第0、7天腹腔注射雞卵清蛋白（OVA）溶液，在第14、15、16天以霧化的OVA熏誘小鼠，1h/次、1次/d；對照組用PBS溶液替代OVA；2組小鼠在第18天回收肺組織，采用免疫熒光染色法評價小鼠哮喘模型的有效性，熒光定量PCR檢測緊密連接相關(guān)蛋白基因Claudin 1、Claudin 3、Claudin 4、Claudin 5、Claudin 7、Clau?din 10在肺組織中的表達。結(jié)果哮喘組Claudin 3、Claudin 4、Claudin 10mRNA水平較對照組低（P＜0.05），而Clau?din 1、Claudin 5、Claudin 7mRNA水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論哮喘病理過程中氣道上皮細胞緊密連接松散，提示氣道上皮屏障破壞。

關(guān)鍵詞：哮喘；連接蛋白類；氣道上皮黏膜；鈣激活氯離子通道蛋白3；緊密連接蛋白；Claudin 3

支氣管哮喘（哮喘）是一種反復(fù)發(fā)作的慢性氣道炎癥性疾病，是各個年齡段均可發(fā)病的一種綜合征，受多種因素的影響[1]。包括兒童在內(nèi)，全球至少有3.34億人患有哮喘[2]。支氣管哮喘的早期主要是分泌物增多、氣道內(nèi)炎性細胞浸潤等一些可逆性的病理改變?？寡祝ǚ婵ㄋ傻龋┗蚵?lián)合支氣管擴張（沙美特羅等）等治療可有效控制哮喘的嚴重程度，但無法根治[3]。氣道上皮黏膜損傷是哮喘氣道炎癥反應(yīng)的初始源頭，損傷后得不到修復(fù)是炎癥持續(xù)存在的主要因素[4]。緊密連接（tight junction，TJ）能選擇性地調(diào)節(jié)離子和其他溶質(zhì)細胞間的運輸[5]，與氣道上皮的完整性密切相關(guān)，但TJ是否與哮喘的病理學(xué)改變有關(guān)，尚少見報道。本研究通過建立小鼠哮喘模型，檢測緊密連接相關(guān)蛋白（Claudins）在哮喘小鼠中的表達，以期揭示哮喘與氣道上皮改變的關(guān)系，為哮喘的治療提供病理學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料健康8～12周齡SPF級C57BL/6小鼠10只，體質(zhì)量20～30 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。哮喘造模用熏箱為自制玻璃箱（27 cm×20 cm×10 cm）。熒光定量PCR儀（Light Cycler 96，Roche），酶標儀（Multiskan Go，Ther?mo）。Trizol（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購（TIANGEN生物），SYBR?Green（Roche）。兔源CLCA3一抗抗體（Abcam），驢源抗兔二抗（Alexa Fluor?594 DonkeyAnti-Rabbit，Invitrogen），DAPI熒光封片劑（DAPI Fluoromout- G，Southern Biotech，0100-20）。

1.2方法

1.2.1小鼠哮喘模型的建立采用隨機數(shù)字表法將10只小鼠分為2組，每組5只。哮喘組于第0、7天腹腔注射雞卵清蛋白（OVA）溶液[10 μg/g，以氫氧化鋁為佐劑，以磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑，配制成質(zhì)量濃度為100 g/L溶液]。在第14、15、16天以霧化的1% OVA（PBS為溶劑）熏誘小鼠，1h/次，1 次/d。對照組以PBS替代OVA，其他條件相同。2組小鼠在第18天處死，取肺組織。

1.2.2免疫熒光染色用7.5%的水合氯醛溶液麻醉小鼠后取出肺組織，10%福爾馬林溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片。5 μm石蠟切片于55℃～60℃烘烤溶解脫蠟，放入煮沸的檸檬酸抗原修復(fù)液中修復(fù)2min；冷卻至室溫，PBS緩沖液泡洗后滴加5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉30min；PBS緩沖液泡洗后加一抗于4℃孵育過夜；PBS緩沖液泡洗，5% BSA稀釋抗體（免疫熒光二抗為1∶500稀釋），加二抗室溫孵育1.5h。PBS緩沖液泡洗后用DAPI熒光封片劑避光封片10min；熒光顯微鏡觀察。

1.2.3熒光定量PCR Trizol法提取肺組織RNA，用50 μL 無RNA酶水（RNase-free water）溶解RNA。檢測RNA質(zhì)量，吸光度（A）260/280值需在1.8～2.0之間；以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄后，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。分別檢測Claudin 1、3、4、5、7和10基因的表達情況，引物由華大基因合成，引物序列見表1。qPCR總反應(yīng)體系10 μL，循環(huán)參數(shù)：50℃2min，95℃預(yù)變性3min，然后95℃10 s，60℃30 s，72℃20 s，40個循環(huán)。待測樣本特定基因相對表達量的計算方法為2-△Ct，樣本特定基因△Ct=該基因循環(huán)閾值（Ct）-內(nèi)參基因（β-actin）Ct值。

Tab.1　Primer sequences表1　引物序列

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用Excel分析數(shù)據(jù)，定量指標采用均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1哮喘模型建立與對照組比較，哮喘組小鼠普遍興奮度降低，食欲減退，體質(zhì)量下降。小鼠肺組織石蠟切片中紅色熒光標記鈣激活氯離子通道蛋白3 （Chloride channel, calcium activated, familymember 3，Clca 3），藍色熒光為DAPI標記的細胞核。倒置熒光顯微鏡下對照組中肺間質(zhì)與肺上皮細胞核藍色著色明顯，大氣道上皮細胞無明顯紅色著色，即無Clca3陽性細胞。哮喘組肺間質(zhì)與肺上皮細胞核藍色著色明顯，大氣道上皮細胞中出現(xiàn)Clca3陽性細胞，明顯多于對照組，證實哮喘造模成功，見圖1。

2.2肺組織緊密連接相關(guān)基因的表達哮喘組肺組織中，Claudin 3、4和10mRNA表達水平較對照組低（均P＜0.05）。其中，Claudin 3的表達水平較其他基因高，且在哮喘組中下降最為明顯。在哮喘組肺組織和對照組肺組織中Claudin 1、Claudin 5和Claudin 7mRNA水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

Fig.2　Gene expression of Claudins in lung tissues during asthma development圖2　哮喘中Claudins基因在肺組織中的表達變化情況

3　討論

哮喘是一種環(huán)境和遺傳因素相互作用引起的復(fù)雜的異質(zhì)性慢性炎癥失調(diào)[6-7]。哮喘的主要病理學(xué)特征包括氣道變應(yīng)性炎癥、分泌物增多、氣道內(nèi)炎性細胞浸潤，并釋放出多種細胞因子[8]。TJ是上皮細胞間屏障重要組成部分，控制電解質(zhì)和生物分子跨上皮運輸，與肺氣道上皮黏膜的完整性密切相關(guān)，Claudins是緊密連接的主要成分。在Claudins家族中，Claudin 3主要在Ⅱ型肺泡細胞中表達，Claudin 4在肺泡上皮細胞中也有表達，急性肺損傷后，Clau?din 4的表達會上調(diào)。Claudin 4表達的增加會增強肺泡上皮的跨膜電阻，Claudin 4基因敲除后，小鼠肺上皮易損性顯著增強[9]。蛋白激酶D（PKD）又能通過下調(diào)Claudin 1來負向調(diào)節(jié)人氣道上皮屏障的形成和完整性[10]。丙烯醛誘發(fā)急性肺損傷后，Clau?din 5表達水平也隨之增加[11]。以上說明在病理環(huán)境下，Claudins的調(diào)節(jié)機制很復(fù)雜。

Clca3是一種可靠的哮喘特異性蛋白[6]。本研究結(jié)果表明，哮喘組中Clca3陽性的細胞明顯多于對照組，證實哮喘造模成功。Claudins與哮喘的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，哮喘病理過程中氣道上皮細胞緊密連接松散，全肺組織中Claudin 3、4、10的下調(diào)能增加上皮對生物分子的通透性，加快炎性因子的跨上皮運輸，加重氣道變應(yīng)性炎癥，從而引發(fā)哮喘。同時本研究發(fā)現(xiàn)，Claudin 1、Claudin 5和Claudin 7的基因表達水平在哮喘中沒有發(fā)生明顯變化。這些Claudin基因表達的變化是否也體現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平上需要進一步的研究考證。

此外，哮喘中還發(fā)現(xiàn)氣道上皮破損的情況，上皮屏障的完整性與哮喘密切相關(guān)[12]。屋塵螨（HDM）過敏原是哮喘患病率增加的原因之一，塵螨Ⅰ類抗原（Der p1）能剪切TJ相關(guān)蛋白ZO1、Occludin和Clau?din 1，使氣道上皮細胞緊密連接松散，進而破壞氣道上皮屏障[13-14]。氣道上皮損傷后能激活Hippo/Yap途徑，肺部損傷修復(fù)的過程中Hippo/Yap途徑可通過調(diào)節(jié)Ajuba，調(diào)控肺上皮干/祖細胞的增殖和分化[15]。因此，Claudins有可能通過調(diào)節(jié)氣道上皮緊密連接間接參與調(diào)控肺上皮損傷修復(fù)的Hippo/Yap途徑，但其中的機制還需要進一步研究?；謴?fù)氣道上皮正常的結(jié)構(gòu)，從而有效終止哮喘氣道炎癥反應(yīng)可作為未來治療哮喘的新方向。

（圖1見插頁）

參考文獻

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（2015-10-10收稿2015-10-28修回）

（本文編輯魏杰）

The pathological changes in airway epitheilal tight junctions inmousemodel with asthma

LI Fan1, WU Qi2△, SUN Xin2, LI Kuan2, ZHANG Yingchao3, LI Xue2, LI Yu2, ZHANG Qiuyang2, XU Long2, CHENhuaiyong2
1 Tianjinmedical University, Tianjin 300070, China; 2 Department of Basicmedical Research,Tianjinhaihehospital; 3 Department of Respiratory, Tianjin Baodihospital△Corresponding Author E-mail：wq572004@163.com

Abstract:Objective To investigate the pathological changes of airway epitheliummucosa in asthmaticmice.Meth?ods Tenmice were divided into two groups: control group and asthma group, fivemice in each group.Asthma group was sensitized with chicken ovalbumin (OVA) by intraperitoneal injection on day 0 and 7.Mice were then challenged with OVA on day 14, 15, and 16, 1hour each time, once a day.Control group was given PBS solution instead of OVA.Lungs were col?lected at day 18 in two groups.Immunofluorescence staining was used to evaluate asthmaticmousemodel.Quantitative PCR was applied to detect the expression of Claudin 1, Claudin 3, Claudin 4, Claudin 5, Claudin 7 and Claudin 10 in lung tissues.Results The expressions of Claudin 3, Claudin 4 and Claudin 10 were significantly lower in asthma group than those in control group (P < 0.05).There were no significant differences in Claudin 1, Claudin 5 and Claudin 7mRNA levels between control group and asthma group (P > 0.05).ConclusionTight junctions of airway epithelium are loosed in asthma, suggest?ing that epithelial permeability is increased.

Key words:asthma; connexins; airway epithelium; chloride channel, calcium activated, familymember 3; tight junc?tion protein; Claudin 3

通訊作者△E-mail：wq572004@163.com

作者簡介：李凡（1990），女，碩士在讀，主要從事呼吸病學(xué)研究

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（31471121）；天津市科委基礎(chǔ)項目（14JCYBJC25700，13JCYBJC40000）

中圖分類號：R562.2+5

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150210

作者單位：1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2天津市海河醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗部；3天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院呼吸科