郭　華, 丁　惠，李慧娟，顏衛(wèi)紅

(山東省立醫(yī)院集團(tuán)東營(yíng)醫(yī)院, 1. 兒科; 2. 手術(shù)室; 3. 血液科, 山東 東營(yíng), 257091)

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兒童病毒性腦膜炎、腦炎中腸道病毒感染的分子生物學(xué)分型檢測(cè)及臨床研究

郭華1, 丁惠2，李慧娟3，顏衛(wèi)紅1

(山東省立醫(yī)院集團(tuán)東營(yíng)醫(yī)院, 1. 兒科; 2. 手術(shù)室; 3. 血液科, 山東 東營(yíng), 257091)

摘要:目的探討兒童病毒性腦膜炎、腦炎中腸道病毒感染的分子生物學(xué)分型。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增并測(cè)序，利用Genbank核對(duì)分型，檢測(cè)東營(yíng)地區(qū)2008年1月-2012年2月63例臨床診斷為病毒性腦膜炎、腦炎患兒腦脊液中的腸道病毒(EV)RNA，并結(jié)合臨床特點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果63例病毒性腦膜炎、腦炎患兒的腦脊液經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，EV感染陽(yáng)性率為74.6%(47/63)。利用通用引物篩選出的陽(yáng)性標(biāo)本，并采用簡(jiǎn)并引物經(jīng)兩次PCR共獲得陽(yáng)性結(jié)果31例(66.0%)。隨機(jī)抽取23條陽(yáng)性片段進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank標(biāo)準(zhǔn)EV毒株進(jìn)行同源性對(duì)比分析，相關(guān)序列同源性均在97%以上。腸道病毒引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床特征在各個(gè)年齡組有所不同, 33例急性期EV患兒腦脊液中白細(xì)胞數(shù)不同程度增高(均數(shù)76×106/L)。結(jié)論EV是兒童無(wú)菌性腦膜炎、腦炎的最主要的病原體。采用RT-PCR可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的腸道病毒；采用分型引物擴(kuò)增并測(cè)序，將EV的VP1部分序列與GENBANK中的EV標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)基因序列的同源性進(jìn)行EV型別鑒定是一種切實(shí)可行的方案。EV引起的病毒性腦膜炎臨床癥狀一般較輕、無(wú)特異性，多數(shù)患兒CSF中白細(xì)胞高于正常范圍。

關(guān)鍵詞:腸道病毒; 病毒性腦膜炎、腦炎; 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

病毒性腦膜炎、腦炎是兒童時(shí)期最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，而腸道病毒(EV)是引起病毒性腦膜炎第一位的病原體[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有1～3 000萬(wàn)人發(fā)生各種類型EV感染，其中EV性腦膜炎約占無(wú)菌性腦膜炎總數(shù)的85%[2], 而國(guó)內(nèi)報(bào)道[3-4]腸道病毒感染占病毒性病毒性腦炎、腦膜炎的69%～84%。本研究以山東省東營(yíng)地區(qū)2008年1月-2012年2月病毒性腦膜炎、腦炎住院兒童病例63例為研究對(duì)象，對(duì)腦脊液中EV行分子生物學(xué)檢測(cè)分型，并探討患兒臨床特征，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2008年1月-2012年2月臨床診斷為病毒性腦膜炎、腦炎患兒為研究對(duì)象，均符合依據(jù)諸福棠實(shí)用兒科學(xué)(第7版)[5]中病毒性腦膜炎、腦炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男43例，女20例，年齡0.8～11歲，平均(6.7±0.2)歲?；純喝朐寒?dāng)天行血常規(guī)生化檢查，確定無(wú)禁忌證后行腰椎穿刺抽取腦脊液。陽(yáng)性對(duì)照為中國(guó)科學(xué)院昆明生物學(xué)研究所提供的COXB3、ECHO30和EV71標(biāo)準(zhǔn)病毒株。陰性對(duì)照為結(jié)核、細(xì)菌性腦膜炎患兒腦脊液和磷酸鹽緩沖溶液。

1.2方法

1.2.1EV RNA的提取和擴(kuò)增：采用改良酸性胍-酚-氯仿一步法(AGPC)提取。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增并測(cè)序，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及PCR擴(kuò)增使用德國(guó)Qiagen公司的One-Step試劑盒

1.2.2引物的設(shè)計(jì)與合成：通用引物根據(jù)EV5c端非編碼區(qū)保守序列，引物1序列: 5c-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3c。引物2序列: 5c-CACYGGATGGCCAATCCA-3c, 擴(kuò)增產(chǎn)物為194 bp的片段。此外，分型引物設(shè)計(jì)了3條簡(jiǎn)并引物，分別為引物02: 5c-ATGTAYGTICCICCIGGIGG-3c、引物03: 5c-ATGTAYRTICCIMCIGGIGC-3c和引物01: 5c-GCICCIGAYTGITGICCRAA-3c, 引物02和03分別與引物01擴(kuò)增。擴(kuò)增片段為450 bp的片段。

1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：應(yīng)用EV分型引物對(duì)VP1段進(jìn)行RT-PCR后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收系統(tǒng)回收純化。先將產(chǎn)物構(gòu)建載體連接入質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染進(jìn)入大腸埃希菌，然后進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序通用引物使用M13R(-48),使用ABI3730型DNA序列自動(dòng)分析儀。EV型別確定序列結(jié)果輸入Genbank, 運(yùn)用BLAST程序進(jìn)行相關(guān)序列的比較，分析結(jié)果同源性最高的序列即為相同型別。研究中采用的EV參比序列均取自Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件，計(jì)數(shù)資料以%表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1通用引物和分型引物檢測(cè)下RT-PCR結(jié)果

采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)獲得陽(yáng)性結(jié)果43例(68.2%), 產(chǎn)物回收后再次行PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果47例(74.6%), 一次和二次PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.6222,P=0.4302)。經(jīng)過(guò)通用引物篩選得到47例樣本，利用分型引物一次PCR擴(kuò)增檢測(cè)得到陽(yáng)性13例(27.7%), 二次PCR陽(yáng)性結(jié)果31例(66.0%), 一次PCR和二次PCR比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.8436,P=0.0002)。

2.2對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照：三株標(biāo)準(zhǔn)毒株(COXB3、ECHO30、EV71)均被通用引物成功擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示為片斷大小為194 bp的清晰單克隆條帶，見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照: 9例非開(kāi)放性頭外傷患兒腦脊液樣本，通用引物擴(kuò)增結(jié)果為陰性，見(jiàn)圖2。

注:1為標(biāo)準(zhǔn)毒株擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶,2~17為臨床標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶圖1 陽(yáng)性對(duì)照通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

注:1~7為陰性對(duì)照標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶,8為標(biāo)準(zhǔn)毒株擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶圖2 陰性對(duì)照組通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖片

2.3分型引物序列測(cè)定結(jié)果

隨機(jī)選出23例行序列測(cè)定，全部測(cè)序成功。將結(jié)果通過(guò)BLAST系統(tǒng)與Genbank進(jìn)行比對(duì)，相關(guān)序列同源性97%～99%, 見(jiàn)表1。

表1　23 例EV臨床毒株與GenBank EV標(biāo)準(zhǔn)

2.4患兒臨床表現(xiàn)和腦脊液檢查結(jié)果

63例急性期患兒臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、易激惹。5歲以上患兒中94.1%(32/34)伴有不同程度的頭痛，32.4%(11/34)伴有畏光的表現(xiàn)，17.6%(6/34)伴有疲勞、乏力、肌痛。對(duì)客觀臨床癥狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)5歲以下患兒發(fā)熱、嘔吐、腹瀉發(fā)生率高于5歲及以上患兒，皮疹陽(yáng)性率近似。僅有3例(4.76%)腦膜炎患兒發(fā)生驚厥。此外，腦脊液檢查顯示，33例白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高，范圍20～790×106/L(均數(shù)76×106/L), 其中≤300×106/L 28例(84.85%), 300～500×106/L 3例(9.09%)，≥500×106/L 2例(6.06%)；腦脊液蛋白含量增高者占44.68%, 2例>800 mg/L; 腦脊液葡萄糖含量降低者占34.04%。

3討論

本研究首先以通用引物，對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)毒株，臨床標(biāo)本及陰性對(duì)照組進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)毒株(COXB3、ECHO30、EV71)經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物均為長(zhǎng)度約194 bp的單克隆帶，條帶清晰、無(wú)非特異性擴(kuò)增；所有陰性對(duì)照標(biāo)本(取自結(jié)核、細(xì)菌性腦膜炎患兒)均不能被擴(kuò)增檢測(cè)。74.6%(47/63)的臨床診斷為無(wú)菌性腦膜炎、腦炎的急性期CSF標(biāo)本中可檢測(cè)到清晰、無(wú)非特異性擴(kuò)增的單克隆條帶，提示在引起無(wú)菌性腦膜炎、腦炎的病原體中，腸道病毒仍占首位。相關(guān)研究[6]報(bào)道，EV感染占病毒性腦膜炎病原體的82.9%～85%, 占病毒性腦炎的10%～20%[7]。此外，研究中EV主要引起急性感染，但是否存在EV慢性低滴度持續(xù)性感染，仍需長(zhǎng)期的隨訪觀察。此外，研究中還觀察到，多數(shù)EV感染患兒腦脊液中白細(xì)胞數(shù)高于正常范圍，蛋白及葡萄糖含量基本正常，僅有少數(shù)病例出現(xiàn)輕度異常，與Sawyer等[8]研究結(jié)果基本一致。少部分患兒腦脊液中白細(xì)胞數(shù)可不增高，考慮可能與部分患兒病情較輕、病程較早有關(guān),尚需進(jìn)一步探討。

EV常見(jiàn)血清型包括柯薩奇A7、9、11, 柯薩奇B1～5型，?？?、6、12、30及EV71等[9]。VP1蛋白是EV主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，即參與維持病毒完整形態(tài)，又和病毒引起宿主細(xì)胞病變密切相關(guān)，此外，其還可作為病毒診斷抗原和DNA疫苗的候選基因[10-14]。本研究中，屬同一型的VP1之間的同源性為97%～99%[15]，而研究顯示不同型別間的VP1同源性只有74%～76%[16]，提示基因分型較傳統(tǒng)血清學(xué)分型的優(yōu)勢(shì)。鑒于VP1可作小RNA病毒科內(nèi)不同屬的分類參考，有學(xué)者利用VP1的3'端設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物成功擴(kuò)增出其中的51個(gè)血清型的標(biāo)準(zhǔn)毒株，其引物設(shè)計(jì)考慮到了VP1氨基酸序列的變異和密碼子的簡(jiǎn)并性，四重密碼子簡(jiǎn)并處設(shè)計(jì)為脫氧次黃嘌呤核苷。本研究中，對(duì)通用引物篩選出的47例EV陽(yáng)性的腦脊液樣本用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，其中31例結(jié)果呈陽(yáng)性，且隨機(jī)抽取腦脊液樣本23例均被成功測(cè)序分型，提示通用引物與分型引物檢測(cè)EV的可行性。應(yīng)用分型引物結(jié)合GenBank標(biāo)準(zhǔn)毒株序列比對(duì)，能克服傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法耗時(shí)長(zhǎng)、繁瑣且有部分病毒株無(wú)法定型等缺點(diǎn)，更為準(zhǔn)確地了解小兒EV感染的病毒型別特點(diǎn)。

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Molecular biology typing and clinical research of enterovirus infection in children with viral meningitis/encephalitis

GUO Hua1, DING Hui2, LI Huijuan3, YAN Weihong1

(1.DepartmentofPediatrics; 2.OperatingRoom; 3.DepartmentofHematology,DongyingPeople′sHospital,Dongying,Shandong, 257000)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the molecular biological types of enterovirus (EV) in infected children with viral meningitis or encephalitis. MethodsA Total of 63 children who suffered from viral meningitis/encephalitis between Jan. 2008 to Feb.2012 at Dongying area were recruited and their cerebrospinal fluid specimens were studied by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and degeneracy primers and sequenced to verify the Genbank classification. Their clinical features were also analyzed. ResultsThe positive rate of EV infection was 74.6 %( 47/63), and the positive results processed by twice PCR was 31 cases (62.0%). A total of 23 positive fragments were randomly selected to conduct the DNA sequencing, with a result of more than 97% by homologous analysis comparison with GenBank standard EV strain. The clinical characteristics of central nervous system infections caused by EV were various form different age groups. The white blood cells in cerebrospinal fluid of the 70.21% cases with acute EV infection were at a high level (with a mean of 76×106/L). ConclusionEV is the major pathogen of aseptic meningitis/encephalitis in children. The method of RT-PCR can detect enterovirus infection in central nervous system quickly and accurately. It is a feasible scheme that conducting EV type identification according to the gene sequence homology, which comparing the VP1 partial sequence in EV with standard EV in Genbank. The white blood cells

in CSF of most cases are higher above normal range.

KEYWORDS:enterovirus; virus meningitis; encephalitis; reverse transcript ion and polymerase chain reaction

基金項(xiàng)目:中國(guó)高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11321792)

收稿日期:2015-11-12

中圖分類號(hào):R 742

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)01-035-04

DOI:10.7619/jcmp.201601011