王雅靈　閔大六

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上?！?00030

骨肉瘤化療耐藥分子機制的相關(guān)研究進展

王雅靈閔大六#

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海200030

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤之一，好發(fā)于兒童及青少年。術(shù)前和術(shù)后化療結(jié)合手術(shù)治療是目前骨肉瘤的主要治療方法。但腫瘤多藥耐藥是骨肉瘤發(fā)生局部復(fù)發(fā)、遠處轉(zhuǎn)移及治療失敗的重要原因。明確骨肉瘤化療的耐藥機制，逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥，降低骨肉瘤患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率對臨床治療有重要意義。本文將對骨肉瘤化療耐藥作一綜述。

骨肉瘤；多藥耐藥；耐藥分子機制；研究進展

骨肉瘤是常見的骨惡性腫瘤之一，其中以股骨遠端和脛骨近端最多見，大約60%的骨肉瘤患者發(fā)病年齡為10～20歲［1］，男性多于女性［2］。20世紀70年代，骨肉瘤標(biāo)準(zhǔn)治療方法是截肢術(shù)，術(shù)后患者5年生存率低于20%［3］。隨著化療藥物的出現(xiàn)和應(yīng)用，目前骨肉瘤患者的治療已形成術(shù)前新輔助化療再擇期手術(shù)，術(shù)后行輔助化療的模式，5年生存率已由20世紀70年代的10%～20%上升至現(xiàn)在的70%～80%［4-5］。骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展是一個異常復(fù)雜的過程，是由多種因素共同引起骨組織發(fā)生變化，最終導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生。但是無論是原發(fā)性骨肉瘤還是轉(zhuǎn)移性骨肉瘤，隨著化學(xué)治療的次數(shù)增多，患者對常規(guī)的化療藥物都會產(chǎn)生耐藥，化療耐藥是骨肉瘤患者治療失敗的主要原因。骨肉瘤患者按標(biāo)準(zhǔn)化療治療后發(fā)生多藥耐藥而導(dǎo)致化療療效不理想仍然是一個尚未解決的問題。

骨肉瘤化療耐藥的發(fā)生與多藥耐藥機制密切相關(guān)。多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指腫瘤細胞長期接觸某一化療藥物，發(fā)生不僅對此種化療藥物耐藥，而且可對其他結(jié)構(gòu)和功能不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。這是腫瘤細胞免受化療藥物攻擊的最重要的防御機制，也是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一。MDR與多種細胞機制相關(guān)，已知的MDR產(chǎn)生機制有：化療藥物在細胞內(nèi)的有效蓄積量減少，如P糖蛋白（P-gp）的外排泵藥機制；機體內(nèi)藥物代謝酶含量或活性以及分布的改變；控制細胞凋亡的相關(guān)基因異常，如蛋白激酶C（PKC）介導(dǎo)的耐藥機制，凋亡與多藥耐藥；細胞內(nèi)與耐藥機制相關(guān)的某些信號通路改變等，如miR-33a通過TW IST/ET-1級聯(lián)通路調(diào)控骨肉瘤耐藥分子。本文主要對近幾年骨肉瘤多藥耐藥的分子機制研究進展進行綜述。

1　多藥耐藥相關(guān)蛋白

腫瘤的多藥耐藥是骨肉瘤化學(xué)治療失敗的重要原因。它可以存在化療之前，患者本身出現(xiàn)耐藥，即天然性耐藥；也可以存在化療之后對化療藥物產(chǎn)生耐藥，即獲得性耐藥。腫瘤的多藥耐藥概念首先由Biedler和Riehm［6］在1970年提出，即腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥的同時，對化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的其他抗腫瘤藥物也可產(chǎn)生交叉耐藥性。

MDR蛋白過表達是耐藥相關(guān)機制之一。MDR蛋白能將細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運出胞外，從而降低細胞內(nèi)藥物蓄積。研究顯示MDR蛋白能夠抑制caspase-3和caspase-8活性（促細胞凋亡關(guān)鍵分子），抑制腫瘤化療藥物介導(dǎo)的細胞凋亡。由ABCB1基因編碼的P-gp是第一個被發(fā)現(xiàn)的MDR蛋白［7］。P-gp是一種相對分子量為170kD的跨膜糖蛋白，它具有能量依賴性“藥泵”功能。P-gp既能與藥物結(jié)合，又能與ATP結(jié)合，ATP供能使細胞內(nèi)藥物泵出細胞外，降低了細胞內(nèi)藥物濃度使細胞產(chǎn)生耐藥性。根據(jù)P-gp的作用機制，有研究發(fā)現(xiàn)通過抑制骨肉瘤耐藥株中P-gp的表達，提高細胞內(nèi)阿霉素的濃度可有效地逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性。Baldini等［8］對92例高級別骨肉瘤的研究表明，28例骨肉瘤P-gp高表達患者的總生存率與64例P-gp低表達患者相比，總生存率明顯降低。而P-gp表達與性別、年齡、壞死程度、組織學(xué)分型無關(guān)。除P-gp之外，其他的耐藥相關(guān)蛋白及乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白也相繼被發(fā)現(xiàn)［9］，所有的這些耐藥相關(guān)蛋白都屬于ATP結(jié)合的運輸?shù)鞍?，這些蛋白能與藥物結(jié)合，改變蛋白構(gòu)象，將細胞內(nèi)腫瘤藥物排出以減少細胞內(nèi)藥物的蓄積。如多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance-associated protein，MRP），位于外側(cè)基底細胞膜上則會促進藥物的吸收分解［10-11］。在跨膜蛋白中，MRP蛋白能促進細胞內(nèi)藥物排出，從而減少細胞內(nèi)藥物蓄積［12-14］。其中MRP1專門定位于小腸及脈絡(luò)膜的基底部，MRP2被發(fā)現(xiàn)存在于腸肝腎的頂端細胞膜上［15-16］，通過與谷胱甘肽結(jié)合，轉(zhuǎn)運非陰離子化合物如長春新堿和阿霉素，將藥物泵出細胞外，從而降低細胞內(nèi)藥物蓄積。在此基礎(chǔ)上，Gomes等［17］發(fā)現(xiàn)骨肉瘤化療的敏感性與MDR1表達水平相關(guān)，MDR1表達水平越高，則細胞對化療藥物敏感性越低，腫瘤細胞越耐藥。Alopecurone B（ALOB）是中藥苦參的一種黃酮類提取物，研究顯示，ALOB通過NF-κB信號通路抑制P-gp的作用，增加細胞內(nèi)藥物蓄積，調(diào)節(jié)阿霉素對MG-63阿霉素耐藥細胞株的耐藥作用，同時也能增強MG-63阿霉素耐藥細胞株對其他傳統(tǒng)化療藥物的敏感性［18］。此外，Trps1轉(zhuǎn)錄因子也與腫瘤細胞耐藥有一定相關(guān)性，Trps1在惡性腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)，編碼包括9個鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子，并且作為乳腺癌和前列腺癌中潛在的細胞腫瘤標(biāo)志物［19-20］。研究表明Trps1與MDR1/P-gp有直接相關(guān)作用，同時Trps1在骨肉瘤細胞系中能夠促進MDR1/P-gp基因的表達。所以Trps1可能會作為一個有前途的分子靶點，在逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療耐藥性機制中發(fā)揮重要作用［21］。

2　細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。谷胱甘肽在谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶（GST-π）的催化下與某些抗腫瘤藥物形成復(fù)合物，成為多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1的底物，并與MRP1相結(jié)合被轉(zhuǎn)運出細胞外，從而使細胞內(nèi)藥物濃度降低，減弱藥物殺傷細胞的作用。人谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）是細胞質(zhì)的谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶細胞解毒酶家族的一部分，其作用是阻止各種各樣的外源性物質(zhì)進入細胞，包括突變劑、抗癌藥物以及藥物的代謝產(chǎn)物［22］?？梢悦鞔_的是GSTP1的過表達與許多腫瘤的化療耐藥密切相關(guān)［23］。有研究發(fā)現(xiàn)在阿霉素和順鉑處理過的骨肉瘤耐藥細胞株中GSTP1表達上調(diào)，表明當(dāng)GSTP1在骨肉瘤SaoS2細胞中發(fā)生過表達時，細胞會產(chǎn)生對阿霉素和順鉑藥物的耐藥。相反，當(dāng)HOS細胞受到阿霉素和順鉑藥物處理后，敲除GSTP1基因，使其在HOS骨肉瘤細胞中表達受到抑制，結(jié)果是骨肉瘤細胞受到阿霉素和順鉑藥物作用后出現(xiàn)凋亡以及細胞內(nèi)大量的DNA損傷［24］。實驗表明GSTP1通過參與MAPK信號通路，抑制JNK磷酸化作用或者促進ERK1/2和p38 MAPK磷酸化作用，避免細胞發(fā)生死亡或凋亡［25-27］。這是因為阿霉素或者順鉑等藥物造成的細胞DNA損傷可介導(dǎo)ERK、JNK、p38 MAPK信號通路的磷酸化，而GSTP1可以調(diào)節(jié)這些信號通路在受阿霉素和順鉑影響的骨肉瘤細胞中的活性，從而影響細胞對化療的耐藥性。

3　信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干擾

耐藥機制往往是通過分子信號通路的激活介導(dǎo)，這些通路的激活會抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，這是為了彌補化療和靶向藥物對細胞抑制的影響。如m TOR信號通路。

m TOR屬于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）蛋白激酶類家族成員，能控制細胞內(nèi)mRNA的翻譯及蛋白轉(zhuǎn)運再調(diào)節(jié)蛋白翻譯，在細胞生長和細胞代謝中起到重要作用。m TOR信號通路的改變在很多腫瘤中普遍存在，包括骨肉瘤。在人類骨肉瘤細胞系中，西羅莫司（雷帕霉素，抗真菌抗生素）能下調(diào)HOS細胞和KHOS/NP細胞中m TOR信號通路活性，延緩細胞周期G1期到S期的過渡并抑制骨肉瘤細胞生長［28］。

一項關(guān)于m TOR/p70S6K轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和骨肉瘤患者預(yù)后之間的相關(guān)性的臨床研究結(jié)果表明，若患者m TOR/p70S6K轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在高表達時，患者總生存期均較短，提示mTOR/p70S6K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對骨肉瘤患者的預(yù)后和生存期有重要意義［29］，這更能證明m TOR通路為骨肉瘤臨床治療的一個潛在靶點。雷帕霉素作為阻斷m TOR通路的免疫抑制劑，在Ⅰ期雷帕霉素臨床藥物試驗中（PPTP）被證明起到廣泛的抗腫瘤作用，包括骨肉瘤［30］。這些研究提示了雷帕霉素聯(lián)合化療藥物治療可能是骨肉瘤治療的未來方向。

野生型p53基因定位于17號染色體短臂，研究表明p53作為抑癌基因在一個合適的時間間隔和足夠的表達量時能抑制骨肉瘤細胞增殖。p53通過對TORC2靶點的作用比雷帕霉素更有效地起到抗骨肉瘤細胞增殖的作用，結(jié)論就是p53通過阻斷PI3K/AKT/m TOR信號通路來抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移、血管生成以及細胞增殖［31］。此外，將野生型p53轉(zhuǎn)染進入多藥耐藥骨肉瘤細胞系后，通過抑制IGF-1r以及前凋亡蛋白p21和Bax在MDR骨肉瘤細胞系中的表達，可以提高化療藥物對多藥耐藥細胞系的敏感性［32］。

4　MicroRNA調(diào)節(jié)異常

M icroRNA（m iRNA）是一類非編碼小RNA分子，參與廣泛的生物學(xué)過程［33-35］。m iRNA突變、異常表達或異常加工均會影響m iRNA正常功能，從而導(dǎo)致靶蛋白表達異常。隨著對m iRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性研究的深入，越來越多的研究證明m iRNA異常表達與各種癌癥有關(guān)［36-37］，且與臨床化療藥物敏感性有一定相關(guān)性。如當(dāng)miR-34a高度表達時，可提高骨肉瘤細胞對阿霉素、長春新堿的敏感性［38］，使化療藥物能更有效地抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。

改變特定的m iRNA表達，調(diào)節(jié)細胞進程會導(dǎo)致不同癌癥的耐藥性。如在骨肉瘤細胞系中，m iR-221和m iR-101通過PTEN/Akt通路介導(dǎo)，發(fā)生表達上調(diào)，從而產(chǎn)生骨肉瘤細胞對順鉑化療藥物的耐藥［33-34］。

與成人正常的成骨細胞相比，m iR-202在骨肉瘤組織中的表達量增高，研究表明m iR-202通過TGF-β1介導(dǎo)表達，將m iR-202轉(zhuǎn)染進入骨肉瘤細胞系，與PDCD4靶點結(jié)合后會出現(xiàn)骨肉瘤細胞對化療藥物的抵抗。相反，將m iR-202抑制劑轉(zhuǎn)染進入骨肉瘤細胞系中，能夠增強化療藥物敏感性以及促進腫瘤細胞凋亡［39］。

此外，研究表明在大部分腫瘤中，m iR-301a是一種具有上調(diào)功能的腫瘤致癌基因。在骨肉瘤中，阿霉素能夠介導(dǎo)m iR-301a在骨肉瘤細胞中的表達。AMPKα1作為m iR-301a的直接靶點基因，通過m iR-301a過表達來調(diào)節(jié)阿霉素對骨肉瘤細胞的作用，促進HMGCR的表達以及抑制AMPKα1的表達。值得注意的是，m iR-301a能夠減少阿霉素介導(dǎo)的細胞凋亡而抗m iR-301a靶點能夠加強骨肉瘤細胞的凋亡，表明上調(diào)m iR-301a可增強骨肉瘤細胞對化療藥物的抵抗而出現(xiàn)耐藥性。研究資料表明對化療藥物抵抗的這些骨肉瘤患者中m iR-301a和HMGCR都處于上調(diào)狀態(tài)。這更加證明了miR-301a可能是一個潛在的骨肉瘤化療耐藥的標(biāo)志物［40］。

此外，m iR-17-92在腫瘤中是專門研究多順反子的集群，包含15個m iRNA形成4個“種子”家庭，分別是miR-17、m iR-18、m iR-19、m iR-92。在很多癌癥中，如彌漫大B淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及骨肉瘤中都有以上這些m iRNA集群的擴增［41-43］。miR-17-92的直接目標(biāo)基因包括E2F1、PTEN和p21［42］。m iR-17-92中兩個成員m iR-17-5p和miR-18a屬于5個高度致癌的m iRNA，在一些骨肉瘤細胞系中表達，提示疾病的預(yù)后不良［43］。由此可以看出，進一步探究骨肉瘤中m iR-17-92的作用是必要的。

m iRNA-155與細胞自噬相關(guān)，并能介導(dǎo)化療藥物在骨肉瘤細胞中的反應(yīng)。miRNA-155能夠在化療藥物介導(dǎo)的細胞自噬中高度表達，上調(diào)m iRNA-155表達水平可以提高化療藥物對細胞自噬的作用，證明miRNA-155通過細胞自噬作用來調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性［44］。此外，提高m iR-217的表達水平可增強對順鉑藥物的敏感性［45］。骨肉瘤細胞對于阿霉素的化療抵抗是與m iR-143的下調(diào)，ALDH1+CD133+的激活，自噬的激活以及相關(guān)的細胞死亡相關(guān)聯(lián)的。miR-143可能在骨肉瘤化療耐藥性中起到一個至關(guān)重要的作用［46］。

5　自噬相關(guān)耐藥

HMGB1是一種核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，在許多細胞內(nèi)都有表達，作為DNA的結(jié)合蛋白，HMGB1參與了DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄，其分泌形式又可發(fā)揮細胞因子樣作用。在骨肉瘤耐藥形成過程中，HMGB1以分泌形式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。HMGB1在骨肉瘤中促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，抑制骨肉瘤細胞凋亡［47］。值得注意的是，研究表明HMGB1可以通過介導(dǎo)自噬來增強藥物抵抗，抑制HMGB1表達可以明顯增強骨肉瘤細胞的藥物敏感性。因此HMGB1可以作為骨肉瘤治療的靶點基因干擾骨肉瘤耐藥進程。

巨噬細胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，M IF）是炎癥相關(guān)的細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)M IF影響乳腺癌對化療藥物的耐藥性，同時一種新穎的雄烯二酮衍生物通過抑制M IF因子介導(dǎo)ROS調(diào)節(jié)的細胞自噬以及降低骨肉瘤細胞對化療藥物的耐藥性［48］。自噬啟動會介導(dǎo)細胞凋亡，但是自噬能夠使腫瘤細胞免受化療藥物的影響，從而抑制腫瘤細胞凋亡［49］。P13K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，PI3K信號參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K/Akt信號通路異常激活會促進細胞程序性死亡，抑制腫瘤的生長。在腫瘤治療研究中，靶向藥物阻斷PI3K/Akt通路的作用越來越重要。P13K能介導(dǎo)對受到順鉑作用的MG63細胞系的細胞自噬，一定程度上提高細胞的自噬能力會降低MG63細胞對順鉑化療藥物的敏感性［50］。

6　腫瘤干細胞和相關(guān)藥物耐藥

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是近年來研究的一個熱點，它具有干細胞的特點，即自我更新、無限增殖及分化潛能，在啟動腫瘤形成和生長中起著決定性的作用［51］。1959年，MAKING［52］提出CSC假說，認為腫瘤中存在一種自我更新和無限增殖的亞群細胞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥方面起到重要作用。CSC具有增強DNA修復(fù)能力，上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達等作用，在骨肉瘤化療治療過程中能逃避化療藥物的毒性作用，一旦化療藥物作用消失，該類細胞可以通過自我更新、無限增殖使腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［53］。因此，常規(guī)的化療藥物只能縮小腫瘤瘤體體積，而CSC未被化療藥物殺死，仍具有自我更新能力，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。在信號通路方面，有研究分析骨肉瘤干細胞具有持續(xù)激活Wnt/β-catenin信號和增強致瘤的潛力。因此，CSC成為腫瘤耐藥的一個重要原因。

7　未來和展望

多藥耐藥是耐藥的重要形式，也是導(dǎo)致骨肉瘤化療失敗的主要原因。骨肉瘤對化療藥物的耐藥是一個多基因多方面作用的結(jié)果。本綜述主要介紹了骨肉瘤抑制化療藥物的6種分子機制，但目前對于骨肉瘤化療耐藥的分子水平研究尚處于初期階段，此外還存在其他機制能引起骨肉瘤細胞的耐藥性，如APE1或ERCC增強DNA修復(fù)，干擾mTOR或IGF-IR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，細胞凋亡和細胞自噬相關(guān)的抗化療機制等。深入研究骨肉瘤耐藥的分子機制對于研發(fā)新的化療藥物以及改善骨肉瘤化療的效果具有重要意義。此外，骨肉瘤耐藥分子標(biāo)志物的尋找仍需進一步研究，這對于骨肉瘤化療的治療和骨肉瘤預(yù)后以及提高患者的生存期都有著重要的意義。

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R738.1

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10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.06

2015-11-30）

（corresponding author），郵箱：mindaliu1969@163.com