張 娜, 乾義柯, 魏 霜, 胡白石，陸 平, 賽鐵爾汗,

劉中勇3, 張永江5, 張祥林6

(1.伊犁師范學(xué)院, 新疆伊寧　835000；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局, 新疆伊寧　835000；3.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局, 廣東汕頭　515041；

4 .南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 南京　290000；5.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所, 北京　100029；

6.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局, 烏魯木齊　830052)

?

基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)的葡萄卷葉伴隨病毒3號(hào)檢測方法

張 娜1, 乾義柯2, 魏 霜3, 胡白石4，陸 平2, 賽鐵爾汗2,

劉中勇3, 張永江5, 張祥林6

(1.伊犁師范學(xué)院, 新疆伊寧835000；2.伊犁出入境檢驗(yàn)檢疫局, 新疆伊寧835000；3.汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局, 廣東汕頭515041；

4 .南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 南京290000；5.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所, 北京100029；

6.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局, 烏魯木齊830052)

摘要：【目的】建立一種快速、靈敏的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)檢測葡萄卷葉伴隨病毒3(Grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3)方法。【方法】根據(jù)GLRaV-3已測序和已報(bào)道的HSP70基因(Heat shock protein 70)保守序列，設(shè)計(jì)用于RPA檢測的特異性引物，建立GLRaV-3的RPA檢測方法，并對其特異性和靈敏度進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】建立RPA檢測方法能夠從GLRaV-3帶毒株中檢測到約380 bp的特異性條帶，僅需在37℃下恒溫反應(yīng)40 min，無需特殊的儀器設(shè)備，經(jīng)特異性評價(jià)特異性好，且該方法與普通PCR檢測靈敏度基本一致?！窘Y(jié)論】建立的RPA檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，無需特殊的儀器設(shè)備，適合GLRaV-3的快速檢測方法。

關(guān)鍵詞：葡萄卷葉伴隨病毒3；RPA；檢測方法

0 引 言

【研究意義】葡萄卷葉病毒病(Grapevineleafroll-associatedvirus，GLRaV)是僅次于葡萄扇葉病毒病的一種世界性葡萄病毒病，在國內(nèi)分布較為普遍，田間感病率較高，對葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大，且引起該病的病毒是由多種病毒單獨(dú)或復(fù)合侵染造成[1-3]?，F(xiàn)已報(bào)道的葡萄卷葉伴隨病毒有11種，分別為GLRaV- 1～9，GLRaV-Dr，GLRaV-De[4, 5]，我國已鑒定明確的葡萄卷葉伴隨病毒種類共有6種，即GLRaV- 1～5和7[6, 7]。GLRaV已被證明屬于典型的Clostero病毒，僅分布于韌皮部和葉片，其傳播不是靠機(jī)械，通常是靠感染的母株或接穗等繁殖材料[8]。其中葡萄卷葉伴隨病毒3(Grapevineleafroll-associatedvirus3，GLRaV-3)是最重要的一種，為葡萄卷葉病毒屬(Ampleovirus)模式Hya種，基因組全長約18 kb，包含13個(gè)開放閱讀框架，分子量為35 kDa的CP由ORF6編碼[9]。它分布最廣泛造成的經(jīng)濟(jì)損失最大，而且也是這幾種病毒中唯一具有自然介體的病毒[10-12]。GLRaV具有半潛隱性，導(dǎo)致葡萄植株生長衰弱，果實(shí)成熟延遲，果粒大小不均，著色不良，含糖量減少，產(chǎn)量下降，對葡萄的生長發(fā)育有顯著影響。因此，研究葡萄卷葉病毒檢測方法對該類病毒檢驗(yàn)檢疫和葡萄無毒苗木生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，檢測葡萄卷葉病毒的方法主要有指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光PCR法。指示植物檢測法比較簡單，但其檢測速度很慢，而且無法確定侵染病毒的種類，靈敏度也較低。葡萄卷葉伴隨病毒ELISA檢測方法[13]靈敏度高，操作簡單，但所需檢測時(shí)間也在1～2，而且抗體制備周期長，費(fèi)用較高，靈敏度不及RT-PCR。利用分子生物學(xué)技術(shù)建立的RT-PCR[14]、免疫捕捉RT-PCR[15]、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR[16]、探針雜交[17, 18]以及LAMP方法[19]檢測結(jié)果更為快速、靈敏，但所需要的檢測設(shè)備和探針試劑成本較高。RPA(Recombinase polymerase amplifcation)是一項(xiàng)新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[20]，其主要原理為利用重組酶和引物形成微絲在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)配對的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下使模板DNA解鏈，引物于模板DNA開始配對，并在DNA聚合酶的作用下復(fù)制延伸。該方法主要具備以下優(yōu)點(diǎn)：(1)僅需1對引物即可完成擴(kuò)增，不需要太復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)過程；(2)只需要37 ℃下恒溫反應(yīng)即可，不需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備；(3)反應(yīng)時(shí)間僅需40 min；(4)結(jié)果易于判斷，不像LAMP產(chǎn)物的彌散帶，RPA擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)具有特定大小的條帶?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國內(nèi)未見報(bào)道有關(guān)RPA技術(shù)在葡萄病毒檢測方面的應(yīng)用，研究依據(jù)GLRaV-3的HSP70基因(Heat shock protein 70)保守序列，設(shè)計(jì)用于RPA檢測的特異性引物，建立GLRaV-3的RPA檢測方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用RPA技術(shù)，建立一種簡便高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法來快速檢測GLRaV-3，以期為葡萄病毒病害的田間診斷、預(yù)測預(yù)報(bào)和葡萄無毒苗木的生產(chǎn)等提供更好的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1　 材 料

含葡萄卷葉伴隨病毒1 (GLRaV-1)、葡萄卷葉伴隨病毒2(GLRaV-2)、葡萄卷葉伴隨病毒3(GLRaV-3)、葡萄卷葉伴隨病毒4(GLRaV-4)、葡萄卷葉伴隨病毒5(GLRaV-5)及葡萄病毒A(GrapevinevirusA，GVA)的葡萄葉片采自新疆伊寧，陰性對照為脫毒葡萄苗，樣品經(jīng)PCR檢測和序列測定確認(rèn)后-80℃凍干保存。

1.2　方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成

參照試劑盒操作(植物總RNA提取試劑盒，天根生物科技有限公司)，提取感病葡萄葉片的總RNA。并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT-PCR Kit，TaKaRa)的操作，將提取的RNA制備成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)

參考RPA引物設(shè)計(jì)的要求[21]，根據(jù)GLRaV-3已測序和已報(bào)道的HSP70基因的保守序列，設(shè)計(jì)檢測葡萄卷葉伴隨病毒3號(hào)的RPA檢測引物，擴(kuò)增條帶380 bp。上游引物GLRaV-3-F：5′-ATTGAGGAACAATTTGGGGGACATCCGGCAA

TACT-3′；下游引物GLRaV-3-R：5′-GAACCGACGTATCAATATCTAACGGCTGCCGACTA-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3RPA檢測

1.2.1中制備的cDNA為模板，采用GLRaV-3-F和GLRaV-3-R引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陰性對照(模板為脫毒葡萄苗葉片cDNA)。RPA擴(kuò)增體系的配制方法如下：向含有凍干酶粉的0.2 mL TwistAmp 反應(yīng)管(TwistAmp Basic kits，Twist)中加入再水化緩沖液(Rehydration Buffer)29.5 μL，去離子水12.5 μL，上、下游引物各2 μL(終濃度為0.4 μmol/L)，模板cDNA 1 μL，最后再加入醋酸鎂溶液2.5 μL(280 mmol/L)。將RPA擴(kuò)增體系充分混勻，置于37℃的金屬浴上反應(yīng)40 min。RPA反應(yīng)結(jié)束后，向RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50 μL苯酚/氯仿溶液，充分混勻后12 000 r/min離心2 min，取上清液5 μL于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.2.4RPA檢測方法特異性評價(jià)

按照1.2.4 RPA檢測反應(yīng)體系，對供試樣品GLRaV-3以及GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-4、GLRaV-5、GVA共6種病毒的cDNA進(jìn)行檢測，同時(shí)用脫毒葡萄苗的cDNA做陰性對照，對所建立的RPA檢測方法特異性進(jìn)行評價(jià)。

1.2.5RPA檢測方法靈敏度評價(jià)

將GLRaV-3帶毒株的總RNA制備的cDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，共6個(gè)稀釋度，以梯度稀釋的cDNA為模板，按照1.2.4所示的RPA檢測反應(yīng)體系進(jìn)行RPA靈敏度實(shí)驗(yàn)，并參照已報(bào)道的GLRaV-3檢測引物P3U/P3D[22]進(jìn)行PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為653 bp，比較兩種方法檢測靈敏度。

2結(jié)果與分析

2.1　GLRaV-3的RPA檢測方法的建立

以含GLRaV-3的葡萄葉片的cDNA為模板，并以脫毒葡萄苗的cDNA為陰性對照，建立了RPA檢測方法檢測GLRaV-3。GLRaV-3擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的條帶大小一致約380 bp，陰性對照脫毒葡萄苗沒有條帶度，建立的RPA檢測體系能夠準(zhǔn)確檢測到GLRaV-3。圖1

M：Marker DL 2000；1：GLRaV-3；2：陰性對照

M：Marker DL 2000；1：GLRaV-3；2：Negative control

圖1 RPA技術(shù)檢測GLRaV-3
Fig. 1 Detection GLRaV-3 by RPA

2.2 　RPA檢測方法的特異性評價(jià)

GLRaV-3的RPA特異性評價(jià)結(jié)果顯示，GLRaV-3樣品能夠檢測到380 bp的特異性條帶，其它5種樣品GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-4、GLRaV-5及GVA均未檢測到條帶，證明該方法具有較強(qiáng)的特異性。圖2

M：Marker DL 2000；1：GLRaV-3；2：GLRaV-1；3：GLRaV-2；4：GLRaV-4；5：GLRaV-5；6：葡萄A病毒

M：Marker DL 2000；1：GLRaV-3；2：GLRaV-1；3：GLRaV-2；4：GLRaV-4；5：GLRaV-5；6：GVA

圖2 GLRaV-3的RPA特異性檢測結(jié)果
Fig. 2 The specificity results of GLRaV-3 by RPA

2.3　 RPA檢測方法與普通PCR方法的靈敏度對比

GLRaV-3的RPA檢測方法與普通PCR方法靈敏度比較檢測結(jié)果顯示，普通PCR反應(yīng)設(shè)置在30個(gè)循環(huán)時(shí)，當(dāng)稀釋度為10-3時(shí)，仍可以檢測到約653 bp的目的條帶；RPA檢測方法反應(yīng)時(shí)間設(shè)置在40 min，當(dāng)稀釋度為10-3時(shí)，也可以檢測約380 bp的目的條帶，當(dāng)稀釋度為10-4時(shí)，兩種方法均未能擴(kuò)增到目的條帶。說明兩種方法靈敏度相當(dāng)。圖3，圖4

M：Marker DL 2000；1-6：cDNA稀釋度依次為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5

M：Marker DL 2000；1-6：The dilution of cDNA were 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5

圖3 GLRaV-3的RPA檢測靈敏度
Fig. 3The detection sensitivity of GLRaV-3 by RPA

M：Marker DL 2000；1-6：cDNA稀釋倍數(shù)依次為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5

M：Marker DL 2000；1-6：The dilution of cDNA were 100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5

圖4 GLRaV-3的PCR檢測靈敏度
Fig. 4 The detection sensitivity of GLRaV-3 by PCR

3 討 論

RPA技術(shù)是近幾年興起的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，目前主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)病原菌、轉(zhuǎn)基因的檢測中[23-27]。研究以葡萄卷葉伴隨病毒模式種GLRaV-3為研究對象，建立了GLRaV-3的RPA檢測方法，并對其特異性和靈敏度進(jìn)行了評價(jià)，為植物病毒的檢測提供一種新的簡便、快捷的檢測方法。

以RPA技術(shù)建立的恒溫?cái)U(kuò)增體系不需要 PCR 儀等熱循環(huán)設(shè)備，37℃下就能對樣品進(jìn)行檢測，而LAMP等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要在60~65℃下進(jìn)行反應(yīng)，因此RPA技術(shù)反應(yīng)溫度更容易達(dá)到?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，Crannell等[28]建立一種不依賴任何儀器設(shè)備，僅僅利用人體體溫來完成擴(kuò)增反應(yīng)的RPA檢測方法。這大大增強(qiáng)了該技術(shù)的適用范圍，尤其適合于現(xiàn)場檢測。

LAMP等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要針對靶基因上6個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)4條引物才能完成擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，需要進(jìn)行大量的優(yōu)化。而RPA 技術(shù)僅需一對引物就可完成整個(gè)擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)相對簡單。另外，LAMP的擴(kuò)增條帶為彌散帶，而RPA技術(shù)的擴(kuò)增條帶根據(jù)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)，為特定大小的單一條帶，RPA的擴(kuò)增產(chǎn)物還可以進(jìn)一步分析。因此，可以類似于普通多重PCR原理根據(jù)不同產(chǎn)物片段大小來判斷結(jié)果。基于以上優(yōu)點(diǎn)，Kersting等建立了一套含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的四重RPA技術(shù)用于檢測三種病原菌[29]。

已報(bào)道的LAMP檢測技術(shù)相對靈敏度在0.1%～0.01%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，與已報(bào)道的RPA檢測技術(shù)靈敏度相當(dāng)[30-31]。研究對RPA檢測技術(shù)與RT-PCR檢測技術(shù)的靈敏度進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種技術(shù)靈敏度相當(dāng)，這與已報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)果一致。而利用添加了探針的RPA實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)，能夠進(jìn)一步提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度[25-27]。當(dāng)然RPA作為一種新興起的檢測技術(shù)，還有許多不足等待完善。首先，RPA體系對于蛋白活性的要求高于Taq酶，體系中任意一種酶失活都將導(dǎo)致 RPA 體系停止工作；其次，RPA擴(kuò)增體系中存在大量蛋白酶，使得 RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物必須除去蛋白后才能電泳或進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。再次，RAA 體系與 PCR 同樣采用正反引物與模版雜交，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。目前, RAA 法還處于初期階段, 但是對于一個(gè)剛出現(xiàn)的新技術(shù)而言, 能夠在體外較低的溫度下最適溫度(37℃)快速擴(kuò)增出目的片段，已經(jīng)是很好的開始。研究所做工作為 RPA 技術(shù)運(yùn)用于植物病毒檢測提供了積累對 RPA 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展具有積極意義。相信隨著反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，RPA 法能夠利用它的優(yōu)勢，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，特別是在檢測(醫(yī)學(xué)檢測、動(dòng)植物檢疫和野外微生物檢測)等方面廣泛發(fā)揮作用。

4 結(jié) 論

以葡萄卷葉伴隨病毒屬模式種GLRaV-3為研究對象，建立了其RPA檢測方法。該方法只需一對引物即可在37℃恒溫條件下完成檢測，并能準(zhǔn)確區(qū)分其它幾種參試葡萄病毒株，其擴(kuò)增條帶為一條380 bp的特異條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后即可用于下游測序、克隆、酶切等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。研究所建立的RPA檢測方法在40 min反應(yīng)條件下的靈敏度與普通PCR在30個(gè)擴(kuò)增循環(huán)下的檢測靈敏度相當(dāng)，反應(yīng)時(shí)間縮短，不需要特殊的熱循環(huán)儀，適合基層單位和現(xiàn)場檢測使用，為葡萄病毒病害的田間診斷、預(yù)測預(yù)報(bào)和葡萄脫毒苗的生產(chǎn)等提供了更為簡便高效的技術(shù)方法，在植物病毒快速檢測方面具有一定的實(shí)踐意義。

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Fund project:Supported by Science and Technology Xinjiang Supporting Program (2013911090)

Based on Recombinase Polymerase Amplification , the Method of

Detection ofGrapevineleafroll-associatedvirus3

ZHANG Na1, QIAN Yi-ke2, WEI Shuang3, HU Bai-shi4, LU Ping2, Saitiieerhan2,

LIU Zhong-yong3, ZHANG Yong-jiang5, ZHANG Xiang-lin6

( 1.YiliNormalCollege,YiningXinjiang835000,China; 2.YiliEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,YiningXinjiang835000,China;3.ShantouEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,ShantouGuangdong515041,China; 4.NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing290000,China; 5.InstituteofPlantQuarantine，ChineseAcademyofInspectionandQuarantine，Beijing100029,China; 6.XinjiangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830052,China)

Abstract：【Objective】 The objective of this study is to develop a recombinase polymerase amplification (RPA) assay for the detection of Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3).【Method】Specific RPA primers were designed based on HSP 70 (heat shock protein 70) gene of GLRaV-3. A RPA assay was developed for the detection of GLRaV-3 after optimization reaction condition. The specificity and sensitivity of this assay were tested. 【Result】The RPA assay proved to be specific. Only a 380 bp fragment were detected in GLRaV-3 by RPA assay. The sensitivity of this RPA assay was consistent with conventional PCR. What was needed was just to keep the temperature at 37 ℃ about 40 min in RPA reaction without using other special equipments. 【Conclusion】This RPA assay proved to be rapid, sensitive and specific for the detection of GLRaV-3.

Key words:Grapevine leafroll-associated virus 3；RPA；method of detection

通訊作者:張祥林(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参餀z疫,(E-mail)XL6479@163.com

作者簡介:張娜(1983-)，女，山西翼城人，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)，(E-mail)yucixue@163.com

基金項(xiàng)目:新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(2013911090)

收稿日期：2015-07-21

中圖分類號(hào)：S41;S182

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-4330(2016)02-0302-07

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.016