俞子萱，楊爽，葛寶坤，宋旭（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

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UPLC法快速測定葡萄酒中的防腐劑脫氫乙酸

俞子萱，楊爽，葛寶坤*，宋旭
（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

摘要：建立超高效液相色譜法（UPLC）、二極管陣列檢測器（PAD）快速測定葡萄酒中防腐劑脫氫乙酸（DHA）的方法。采用甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（體積比=20∶80，pH=7.5~8.5）作為流動相，流速為0.25 mL/min，柱溫為35℃，檢測波長為293nm。該方法以保留時間（Rt）定性，外標法定量，在5.0 mg/L~200.0 mg/L范圍內待測組分的峰面積與濃度有良好的線性關系，R2>0.9999，樣品在5.0、10.0、25.0mg/L 3個加標水平回收率范圍為87.0%~101.2%（n=10），相對標準偏差小于3%，該方法的定量限（LOQ）為5.0mg/L。

關鍵詞：葡萄酒；脫氫乙酸；超高效液相色譜法；二極管陣列檢測器

脫氫乙酸（Dehydroacetic acid），別名二乙酰基乙酰乙酸，是一種低毒高效的防腐、防霉劑，防腐效果是苯酸鈉的2倍~10倍，在酸、堿條件下均具有一定的抗菌作用，尤其對霉菌的抑制作用最強[1-2]，因此，在食品中常被用作防腐劑、防霉劑[3-4]。但脫氫乙酸因具有一定的毒性，其安全性也受到質疑[5]；我國GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[6]規(guī)定：脫氫乙酸可用于黃油、醬菜、發(fā)酵豆制品、面包、糕點、焙烤食品餡料、復合調味料、果蔬汁。由于脫氫乙酸在該標準中的使用范圍并不包括葡萄酒，因此，脫氫乙酸在葡萄酒中為違規(guī)添加劑。目前，一些葡萄酒生產商利用脫氫乙酸良好防腐效果在葡萄酒中違規(guī)添加[7-8]，因此，建立葡萄酒中脫氫乙酸的測定方法尤為必要，它可彌補國標方法的不足。目前文獻報道的脫氫乙酸檢測方法主要有氣相色譜法[9]、液相色譜法[10]，但上述方法存在或前處理復雜、或檢測速度慢、或靈敏度不高、或不適于葡萄酒等問題[11-18]；本文建立了采用UPLC快速測定葡萄酒中脫氫乙酸的方法，極大地提高分離效率和分析速度，該方法前處理簡單，分析流程短，檢出限低，回收率高，可以快速、簡便、準確檢測葡萄酒中的脫氫乙酸。

1材料與方法

1.1儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（PDA）：美國Waters公司；MILLI-Q純水儀：MILLIPOR公司；8893E-TDH超聲波萃取儀：美國科爾帕默公司。

1.2試劑

甲醇（色譜純）：北京迪馬科技；脫氫乙酸標準品（純度99.9 %）：CHEM SRVICE公司；乙酸銨、氨水、氫氧化鈉（均為優(yōu)級純）：天津化學試劑二廠。

1.3方法

1.3.1樣液的制備

取一定的葡萄酒樣品，超聲波10 min或水浴加熱5 min冷卻，再取1.0 mL樣液用流動相對倍稀釋，混勻，定容液過0.45 μm水系濾膜，進UPLC分析測定。

1.3.2超高效液相色譜條件

色譜柱：Waters公司，C18柱，1.7μm，2.1mm×100mm，或相當者；流動相：甲醇∶0.02 mol/L乙酸銨溶液（pH= 7.5~8.5）=20∶80；恒流速：0.25 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：1.0 μL；波長：293 nm。

1.3.3分析測定

根據(jù)樣液中被測組分的含量，選擇線性范圍內的曲線點，依Rt結合PDA光譜圖定性、峰面積定量，在1.3.2色譜條件下，DHA標準溶液色譜圖見圖1、陽性樣品色譜圖見圖2。

圖1 5.0 mg/L的DHA標準溶液色譜圖Fig.1 5.0 mg/mL DHA standard

圖2 24.5 mg/L的DHA葡萄酒樣品色譜圖Fig.2 24.5 mg/L DHA sample standeard addition

2結果與討論

2.1前處理方法的優(yōu)化

本論文對文獻報道[6，9]的脫氫乙酸前處理方法進行研究，發(fā)現(xiàn)大部分試驗針對高蛋白樣品，用氫氧化鈉溶液提取樣品中脫氫乙酸，再經脫脂、去蛋白處理后經高效液相色譜紫外檢測器測定，而此類方法操作復雜，不適用于基質簡單的酒類產品中脫氫乙酸的檢測。研究還發(fā)現(xiàn)去除葡萄酒中乙醇和氣泡主要有加熱法、微波法兩種方法[7，13]。本試驗采用上述兩種方式，對去除的時間和去除效果的進行觀察，研究表明：水浴加熱5 min和微波提取10 min對脫氫乙酸的測定結果無顯著性差異。

2.2色譜柱的選擇

根據(jù)色譜柱類型不同，本文分別選?、貱18，1.7μm，2.1 mm×100 mm，②C18，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，③C8，1.7 μm，2.1 mm×100 mm，④C8，1.7 μm，2.1 mm×50 mm，4種色譜柱，研究其對測定結果的影響。研究表明：與C18柱相比，C8柱對脫氫乙酸分離度較差，而在長度為50 mm的色譜柱下脫氫乙酸出峰時間較快，不能與溶劑峰很好的分離。因此，選用C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm的色譜柱能得到較好的試驗結果。

2.3流動相的pH對分離效果的影響

根據(jù)脫氫乙酸的理化特性，本文研究了流動相在pH =3.0~4.5、pH =4.5~6.0、pH =6.0~7.5、pH =7.5~8.5條件下對測定結果的影響，研究表明：pH =3.0~4.5、pH = 4.5~6.0 2個酸度條件下脫氫乙酸容易電離，出現(xiàn)拖尾峰，而pH =6.0~7.0和pH =7.5~8.5時脫氫乙酸不易電離，峰形呈均勻的正態(tài)分布，在考慮色譜柱的壽命、分離效果以及脫氫乙酸在弱堿性條件下有較好的溶解性，本試驗選擇將流動相pH=7.5~8.5范圍內進行測定。

2.4方法的回收率與精密度

按照1.3.1方法操作，在5.0、10.0、25.0 mg/L 3個加標水平下進行加標回收試驗，結果平均回收率87.0 %~ 101.2 %（n=10），精密度小于3.0 %，方法的穩(wěn)定性良好，結果見表1。

2.5標準曲線及線性關系

取脫氫乙酸標準溶液，用流動相稀釋成濃度在5.0 mg/L~200.0 mg/L的范圍內，按照本方法色譜條件分析測定，繪制標準曲線，脫氫乙酸在上述濃度范圍內有良好線性關系，線性方程為Y=1.33×104X-3.55× 103，其相關系數(shù)R2大于0.999 9。

2.6方法的檢出限

按上述樣品制備方法，在一系列樣品中加入脫氫乙酸標液后，由高濃度到低濃度依次用空白樣液逐級稀釋，混勻、定容。按照本試驗方法和色譜條件分析測定，根據(jù)選擇合適的噪比S/N=10時的加標濃度計算本方法的定量限（LOQ）值為5.0 mg/L。

表1方法的靈敏度、線性關系及回收率（n=10）Table 1 Sensitivities，linearships and recoveries of the method（n=10）

2.7方法的抗干擾能力研究

為了確定本方法的抗干擾能力，采用在葡萄酒樣品中添加一定量且有可能添加的苯甲酸、山梨酸、胭脂紅、莧菜紅、誘惑紅、偶氮紅，按照上述方法進行分析測定，結果顯示，上述添加劑均不干擾脫氫乙酸的測定。

2.8方法的適用性

分別選取進口和超市購買的常見品牌的干紅、干白、甜白、起泡酒、半干高泡葡萄酒樣品，按照本方法條件進行測試，結果顯示在各類型葡萄酒中脫氫乙酸的色譜峰分離度和重現(xiàn)性均較好，符合分析方法的要求，因此，本研究建立的方法適用于多種類型的葡萄酒中脫氫乙酸的測定。

3　結論

本文研究的檢測脫氫乙酸方法在5.0 mg/L~ 200.0 mg/L的濃度范圍內，有良好的線性關系，相關系數(shù)大于0.999 9；樣品在5.0、10.0、25.0 mg/L 3個加標水平內的回收率范圍為87.0 %~101.2 %，相對標準偏差小于3 %；方法的定性檢出限（LOD）為2.0 mg/ L、定量檢出限（LOQ）為5.0 mg/L，符合色譜分析的方法要求。本研究方法具有操作簡單、快速、靈敏、不需要SPE凈化柱和昂貴的質譜設備，便于推廣與應用。

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Ultra Performance Liquid Chromatography（UPLC）Method for Determination of Dehydroacetic Acid（DHA）in Wine

YU Zi-xuan，YANG Shuang，GE Bao-kun*，SONG Xu
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：A method was developed for the rapid determination of dehydroacetic acid（DHA）in wine . The sample was tested by ultra performance liquid chromatography（UPLC）with diode array detector（PDA）. The mobile phase was methanol-0.02 mol/LAmmonium acetate（mL∶mL=20∶80，pH=7.5-8.5），flow rate was 0.25 mL/min，column temperature was 35℃，determine wavelength was 293 nm. The method for qualitative analysis was based on retention time. And external standard method was used for calculation. Good linear relationship was achieved in the range of 5.0 mg/L-200.0 mg/L for DHA with correlation coefficients above 0.999 9. The recoveries of the method ranged from 87.0 % -101.2 %（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）less than 3 % at 3 spiked levels of 5.0，10.0，25.0 mg/L. The limit of quantification（LOQ）was 5.0 mg/L for DHA.

Key words：wine；DHA；UPLC；PDA

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.040

*通信作者：葛寶坤（1968—），男（漢），研究員，致力于食品安全與殘留檢測技術。

作者簡介：俞子萱（1990—），女（蒙古），助理工程師，本科，研究方向：進出口酒類安全檢測技術。