萬玉林， 葛玉鳳， 武發(fā)菊， 安芳蘭， 劉學榮， 楊進才， 張云德　(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

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獸用疫苗生產(chǎn)中支原體污染檢測和預防

萬玉林， 葛玉鳳， 武發(fā)菊， 安芳蘭， 劉學榮*， 楊進才， 張云德(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046)

摘要細胞培養(yǎng)中支原體污染嚴重影響獸用生物制品的質(zhì)量和安全性，會造成巨大的經(jīng)濟損失。對獸用疫苗生產(chǎn)中支原體污染檢測方法、相關衍生技術及其預防控制等方面進行了綜述，旨在為獸用生物制品生產(chǎn)過程中支原體污染的檢測工作提供參考。

關鍵詞支原體；疫苗生產(chǎn)；污染；檢測；預防

1898年，Nocard和Reux首次從患傳染性胸膜肺炎病牛中分離出支原體。隨著診斷技術的提高，人們對支原體的認識不斷深入，目前在自然界中該類微生物近100余種，可直接或間接引起人類及動植物各種疾病。國內(nèi)外均有研究表明，支原體感染可引發(fā)人和動物呼吸道感染、生長發(fā)育停滯及免疫系統(tǒng)損傷，同時對以培養(yǎng)細胞為材料的生物制品生產(chǎn)亦是棘手問題，因而引起了醫(yī)學界和獸醫(yī)工作者的廣泛關注。筆者對獸用生物制品生產(chǎn)中3種支原體檢測方法(傳統(tǒng)檢測法、血清學檢測法及分子生物學法)及相關衍生技術進行了比較，并結合了預防支原體污染的有效措施，以期為獸用疫苗生產(chǎn)中細胞培養(yǎng)物的支原體污染提供準確簡便的檢測手段。

1支原體的特性及檢測重要性

支原體(Mycoplasma)隸屬柔膜體綱，是一類缺乏細胞壁的原核微生物，其個體微小，介于細菌和病毒之間，呈高度多態(tài)性，可通過常用的濾菌器，其毒株主要通過特殊的結構黏附于宿主細胞膜上，并與相應的受體結合，引起宿主細胞膜結構的改變及誘導宿主細胞產(chǎn)生某些細胞因子，如白細胞介素、干擾素等，從而促使宿主細胞免疫反應異常誘發(fā)各種疾病。在獸用疫苗生產(chǎn)中，由支原體引起的細胞污染發(fā)生率可達30%～60%，支原體污染可引起細胞生長抑制、DNA片段化及碳水化合物、核酸和蛋白質(zhì)的合成受阻[1]，進而影響獸用生物制品的質(zhì)量和安全性。寧宜寶等[2]采用培養(yǎng)分離法對78批普通雞胚制活毒疫苗和31批雞胚成纖維細胞制疫苗進行了支原體檢測，結果表明國內(nèi)普通疫苗和細胞生產(chǎn)活毒疫苗支原體污染嚴重，不僅造成了生物制藥企業(yè)巨大的經(jīng)濟損失，而且對疾病防疫工作帶來困難。WHO和新獸藥典規(guī)定所有細胞生產(chǎn)的活疫苗都不能檢測到支原體污染，因此在生物制品生產(chǎn)過程中支原體的檢測工作極為重要。

2支原體的檢測

2.1傳統(tǒng)檢測方法

2.1.1直接培養(yǎng)法。在《中華人民共和國獸藥典》2010年版附錄[3]中有規(guī)定，支原體直接培養(yǎng)法為支原體檢測的標準方法。通過將樣品接種到支原體培養(yǎng)基上，觀察液體培養(yǎng)基的顏色變化和固體培養(yǎng)基上是否有支原體菌落來判斷試驗結果，準確率高，但培養(yǎng)時間較長，一般在28 d左右，并且在同一培養(yǎng)基中不能完全檢測出所有的支原體類型，常用于對種毒和成品的檢測。

2.1.2DNA熒光染色法。DNA熒光染色法，又稱指示細胞法，是將待測樣品接種于指示細胞中培養(yǎng)，以特異性熒光染料染色，通過在熒光顯微鏡下觀察附著在細胞表面的支原體DNA著色來判斷有無支原體污染。此檢測方法耗時短，可同時檢測多個樣品，且能檢測出培養(yǎng)法無法檢測的支原體，若在配苗前進行初檢，去除不合格樣品，可以有效減少生產(chǎn)損失，保證疫苗質(zhì)量。唐書謙等[4]分別采用DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法對細胞培養(yǎng)中常用細胞系及培養(yǎng)基進行了支原體檢測，結果表明DNA熒光染色法較直接培養(yǎng)法敏感性高，簡單、方便，需時較少，結果穩(wěn)定可靠。

1987年，美國食品和藥品管理局(FDA)提出對全部細胞系和用細胞生產(chǎn)的活疫苗必須檢查支原體，推薦采用DNA熒光染色法[5]。但是，因細胞核酸碎片易黏附至細胞膜上或樣品原因極易引起誤判，因此需要更簡單有效的檢測方法。2.2血清學法

2.2.1被動顆粒凝集試驗(PPA) 。將可溶性抗原或抗體吸附于與免疫無關的、一定大小的顆粒狀載體表面，并與相應的抗體或抗原作用，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下即可發(fā)生凝集，稱為被動顆粒凝集反應。此方法可應用于細菌、支原體的鑒定和抗體的定性檢測。吳曉等[6]分別用被動顆粒凝集試驗、ELISA法、金標滲濾法及冷凝集試驗進行了肺炎支原體的檢測，通過比較不同滴度抗體的靈敏性和特異性，結果表明被動凝集法操作簡單，精確性和敏感度更高，更適宜于臨床應用。

2.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。1971年，Engvall 等[7]建立了一種生物活性物質(zhì)微量測定新技術，即ELISA 檢測法，是目前診斷人和動物肺炎支原體的較實用和可靠的方法之一，主要包括間接法、雙抗體夾心法和抗原競爭法。因其檢測方法簡單，具有良好的特異性和敏感性，一次可以完成大量樣品的檢測，已廣泛應用于臨床醫(yī)用作為肺炎支原體檢測的常規(guī)方法。崔玉明等[8]用不與Mg發(fā)生交叉反應的Mp單克隆抗體建立雙抗體夾心ELISA法檢測上呼吸道分泌物中肺炎支原體抗原的方法，為臨床診斷Mp感染提供了一種有效的方法。

2.3分子生物學技術

2.3.1PCR檢測技術。由于支原體生長緩慢、營養(yǎng)要求高、種間存在交叉抗原等生物學特性，支原體的傳統(tǒng)檢測法和血清學法具有一定的局限性[9]。隨著對支原體的核酸結構、分子組成及其特異性的了解，20世紀90年代初國際上已將PCR技術應用于支原體檢測中，其主要通過病毒模板RNA/DNA抽提、PCR擴增、電泳等技術觀察目的條帶的存在與否，判斷樣品有無支原體污染。賈麗艷等[10]運用支原體的16S rRNA基因序列設計特異性引物，以獸用生物制品中常見的支原體DNA為模板進行PCR擴增，優(yōu)化反應體系，建立了獸用疫苗支原體污染的PCR檢測方法。該方法與傳統(tǒng)的直接培養(yǎng)法相比具有更高的特異性和靈敏性，已廣泛應用于獸用生物制品的生產(chǎn)中，但其對試驗環(huán)境和儀器要求高，易交叉污染[11]。

2.3.2巢式PCR 檢測法。在PCR方法的基礎上進一步優(yōu)化，通過設計巢式 PCR 引物，根據(jù)擴增后目的片段的有無判斷污染情況，并根據(jù)片段大小判斷支原體污染類型，進而推斷污染源。由于類支原體16S～23S rDNA的種屬差異性，李菁竹[12]利用ISR序列對細胞污染中常見的5種支原體進行巢式PCR擴增，通過考察檢測限、特異性及耐受性等參數(shù)發(fā)現(xiàn)此方法可以同時有效檢測多種支原體引起的污染，具有高靈敏性、高度特異性、簡單快速、避免交叉污染等特點，使多個取樣點的在線檢測成為可能，可有效應用于生產(chǎn)過程的控制，防止污染的蔓延，確保疫苗生產(chǎn)質(zhì)量。

2.3.3實時熒光定量PCR技術。1996年，美國Applied Biosystems公司首次推出實時熒光定量PCR法[13]，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析。宋建領等[14]建立了豬肺炎支原體的實時熒光定量PCR檢測方法，特異性、敏感性及重復性試驗表明僅豬肺炎支原體檢測結果均為陽性，可檢測到101copies/μL DNA 模板，每份樣品的變異系數(shù)均小于5%，表明該方法精確、靈敏、重復性高。目前，該方法已被應用于動物營養(yǎng)與繁殖、動物遺傳育種及動物疾病檢測和預防等領域，但由于無統(tǒng)一標準品、不能監(jiān)測擴增產(chǎn)物的大小、熒光素種類和檢測光源的局限性及檢測成本高等因素的制約，因而限制了其廣泛應用。

2.3.4DNA分子雜交檢查法。在原核生物中，rRNA是高度保守的。提取已知支原體的rRNA，克隆至質(zhì)粒PBR325中進行擴增，以缺刻轉(zhuǎn)移法制成P32標記的探針。將待檢查的細胞消化懸浮后，低速離心，取其上清液，提取DNA后用EcoR I降解2 h，凝膠電泳，采用Southern blot法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以探針在膜上與之雜交。此膜X光底片重迭放置24～48 h即可根據(jù)探針存在的部位判定結果。此檢測方法特異性高，支原體探針與大多數(shù)原核細胞DNA可雜交，不會與真核細胞DNA雜交，可完成支原體種類的大致鑒別。

3預防與控制

自然界存在的支原體有120多種，但在生物制品的生產(chǎn)過程中有95%以上的支原體污染來自豬源的豬鼻支原體、牛源的精氨酸支原體和萊氏支原體、人源的口腔支原體和發(fā)酵支原體。在感染的組織細胞中，支原體的密度可高達107克隆單位/mL，可引起細胞形態(tài)和遺傳物質(zhì)的改變，干擾病毒復制，也可引起宿主細胞免疫能力的改變，誘導干擾素的產(chǎn)生。因此，在以培養(yǎng)細胞為材料的獸用疫苗生產(chǎn)中，支原體的防治工作尤為重要。國內(nèi)外均有文獻報道可使用抗生素(如卡那霉素)阻斷支原體核糖核蛋白體循環(huán)過程[15]，但可能影響細胞的正常生理功能，甚至可能對細胞造成毒害作用，在使用中應控制其劑量(50～100 U/mL)。在糾正支原體污染過程中，保持細胞營養(yǎng)液為酸性環(huán)境(pH 6.6～6.8)，可以有效抑制支原體生長。也有學者提出將有效的抗生素配合克隆，如使用泰霉素和麥諾霉素處理支原體污染的細胞后，可以有效緩解支原體污染狀況，且操作簡單，毒副作用較小，但不能完全去除。目前，在獸用生物制品生產(chǎn)中，支原體種類的鑒定及檢測主要是為了檢測細胞的污染源，從而切斷污染源，以期進行有效預防與控制。較常用的支原體檢測方法是直接培養(yǎng)法，但僅依靠此方法還遠遠不能滿足實際快速、準確檢測的需要，應將ELISA法、常規(guī)PCR、實時熒光定量PCR、DNA分子雜交檢查法等方法與分離培養(yǎng)法結合使用，以適應不同來源樣本的特殊檢測要求。4展望

支原體污染的診斷是獸用疫苗生產(chǎn)中保證產(chǎn)品質(zhì)量的關鍵技術。今后，相關研究的發(fā)展方向有：①通過建立準確、快速、簡便的檢測方法，有效減少下游產(chǎn)品的污染；②研制特異性及敏感性高的支原體檢測試劑盒，快速準確檢測疫苗生產(chǎn)中細胞培養(yǎng)物支原體污染，對獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)成本控制有重要意義。

在防治方面，建立有效預防的支原體疫苗是今后支原體檢測工作的研究重點。雖然對家畜支原體疫苗的研發(fā)已取得了一定進展，但由于受佐劑、免疫途徑及載體等因素的影響，免疫效果均較差，目前還未商品化，尚需進一步探索。

參考文獻

[1] NIKFARJAM L，F(xiàn)ARZANEH P.Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture[J].Cell journal,2012，13(4)：203-212.

[2] 寧宜寶.國內(nèi)禽用活病毒疫苗中支原體污染的調(diào)查報告[J].中國獸藥雜志，1993，21(1)：34-36.

[3] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典:2010年版[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[4] 唐書謙，伍津津,楊濤，等.細胞培養(yǎng)中污染支原體的檢查[J].第三軍醫(yī)大學學報，2009，31(23)：2403-2404.

[5] 黃海波.細胞培養(yǎng)感染支原體的檢測和清除研究進展[J].中國獸藥雜志，1997,27(3)：57-60.

[6] 吳曉，鄭穎,趙志鋼，等，被動凝集法檢測肺炎支原體抗體的實驗室研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19(12)：2886-2888.

[7] ENGAVALL E，PERLMANN P.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G[J].Immunochemistry,1971,8：871-874.

[8] 崔玉明，蔡平生，郭善原，等.雙抗體夾心ELISA法檢測肺炎支原體抗原方法的研究[J].中國人獸共患病雜志，2002，18(4)：120-121.

[9] 姚曉輝，練炳洲，王林川，等.支原體檢測方法的建立及在疫苗檢驗中的應用[J].中國動物保健，2010：23-26.

[10] 賈麗艷，李彥明，張映.獸用疫苗支原體污染的PCR檢測技術的建立及應用[J].動物醫(yī)學進展，2005，26(6)：55-58.

[11] 魏欣球.三種血清學方法檢測肺炎支原體抗體的比較[J].醫(yī)學理論與實踐，2010，23(3)：328-329.

[12] 李菁竹.支原體污染的巢式PCR檢測法的摸索及其初步驗證[D].武漢：武漢生物制品所，2010:1-59.

[13] 周曉麗，朱國坡,李雪華，等.實時熒光定量 PCR 技術原理與應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010,37(2)：87-89.

[14] 宋建領，高華峰，信愛國，等.豬肺炎支原體實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用[J].畜牧與獸醫(yī)，2013,45(5)：71-74.

[15] 何大澄，張鴻卿,薛紹白.支原體污染防治研究的新進展[J].細胞生物學雜志，1986，8(1)：23-26.

Detection and Prevention of Mycoplasma in the Production of Veterinary Vaccines

WAN Yu-lin, GE Yu-feng, WU Fa-ju, LIU Xue-rong*et al

(China Agriculture Vet. Bio. Science and Technology Co. Ltd., Lanzhou, Gansu 730046)

Key wordsMycoplasma; Vaccine production; Pollution; Detection; Prevention

AbstractMycoplasma contamination in cell culture affects the quality and safety of veterinary biological products, and can cause huge economic losses. In this research, we reviewed the veterinary mycoplasma contamination detection method, related derivative technology and prevention used in vaccine production, aiming at providing the references for mycoplasma contamination detection during the production of a veterinary biological production.

基金項目蘭州市科技計劃項目(2014-1-143)。

作者簡介萬玉林(1976- )，男，甘肅隴南人，助理研究員，碩士，從事口蹄疫疫苗生產(chǎn)與細胞培養(yǎng)工藝研發(fā)。*通訊作者，副研究員，碩士，從事國家重大動物疫病預防用生物制品技術研發(fā)。

收稿日期2016-01-29

中圖分類號S 859.79

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-081-02