劉承源，王　輝，邱文昌，何亨輝，方炎明

( 1．南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心生物學(xué)與環(huán)境學(xué)院，南京210037; 2．深圳市公園管理中心園藝推廣部，廣東深圳518040 )

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基于過氧化物同工酶分析月季種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及雜種真實(shí)性

劉承源1，2，王輝2，邱文昌2，何亨輝2，方炎明1*

( 1．南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心生物學(xué)與環(huán)境學(xué)院，南京210037; 2．深圳市公園管理中心園藝推廣部，廣東深圳518040 )

摘要:為了提高種質(zhì)資源利用率，加速月季育種進(jìn)程，對27份月季種質(zhì)及3個雜交組合的8個雜交后代，采用過氧化物酶( POD)同工酶方法分析其親緣關(guān)系并進(jìn)行雜種真實(shí)性鑒定。結(jié)果表明:月季種質(zhì)采用POD同工酶分析具有一定的可行性。酶譜分析中，在相對遷移率為0．264～0．858的位點(diǎn)處共獲得7條酶帶，其中共有酶帶3條，特征酶帶4條，表明不同月季種質(zhì)間遺傳多樣性豐富，但又存在一定同源性?；诿笌卣鬟M(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)為0．57處，可將27份供試材料分為3個大組。合柱組與月季組材料聚在一個大組中，兩個組在形態(tài)上的相似性再次得到確認(rèn)。金櫻子與碩苞薔薇分別聚在兩個不同的組中，表明二者之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。供試的古老月季品種被聚在兩個不同的大組中，與野生種聚成的一組呈平行關(guān)系，表明古老月季在起源上的差異較大，可利用其作為雜交親本進(jìn)行廣泛雜交以選育具有豐富遺傳多樣性的雜交后代。根據(jù)有無父本特征酶帶對雜種后代真實(shí)性進(jìn)行鑒定，初步確定2個雜交組合的6個雜交后代中5個為真實(shí)雜種，1個為自交種。該研究結(jié)果為進(jìn)一步開展月季遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:月季，過氧化物酶，親緣關(guān)系，雜種鑒定，聚類分析

劉承源，王輝，邱文昌，等．基于過氧化物同工酶分析月季種質(zhì)資源的親緣關(guān)系及雜種真實(shí)性［J］．廣西植物，2016，36( 1) : 114－120

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月季隸屬薔薇科薔薇屬( Rosa L．)，該屬約有近200種野生資源( Rehder，1940; Ku＆Robertson，2003)和30 000余個園藝品種( Cairns，2007)，但參與現(xiàn)代月季演化的野生資源僅為7個( Wylie，1954)，分別為月季花( R．chinensis)，巨花薔薇( R．gigantea)，多花薔薇( R．multiflora)，異味薔薇( R．foetida)，法國薔薇( R．gallica)，麝香薔薇( R．moschata)，光葉薔薇( R．wichuraiana)。另外，在現(xiàn)代月季的育成中起了重要作用的中國古老月季( Chinese old garden roses)也未能得到充分應(yīng)用( Wang，2007;張佐雙和朱秀珍，2006)。因此，與野生資源和古老月季豐富的遺傳多樣性相比，現(xiàn)代月季的遺傳背景較窄( Matsumoto et al，1998)?，F(xiàn)在世界各地的月季育種工作者普遍認(rèn)識到，要使現(xiàn)代月季育種有新的突破，必須進(jìn)一步導(dǎo)入野生資源和古老月季的優(yōu)良性狀(張佐雙和朱秀珍，2006; Debener ＆Mattiesch，1999)。

由于月季資源種類繁多，來源多樣，加之廣泛的種內(nèi)變異、多倍化及種間雜交，使其種質(zhì)資源復(fù)雜多樣，分類和鑒定工作難度較大( Wissemann，2003)。同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，是基因在蛋白質(zhì)水平上的表現(xiàn)型，既有相對的穩(wěn)定性，又有種屬的特異性，因此，同工酶能夠反映物種基因水平的差異(胡能書和萬賢國，1985)。過氧化物同工酶( POD)是細(xì)胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用保護(hù)系統(tǒng)的主要成分之一，在植物次生代謝系統(tǒng)中起著重要的作用，同時，又是一種重要的遺傳標(biāo)記酶。POD被廣泛應(yīng)用于研究植物種類間的親緣關(guān)系(李學(xué)強(qiáng)等，2010)，種質(zhì)資源的遺傳多樣性(李強(qiáng)棟等，2012;王玉榮等，2013;陳立強(qiáng)等，2014)，逆境條件下植物的生長發(fā)育(陸曉民等，2011;張清等，2004)及雜種后代真實(shí)性鑒定(郭海林等，2006)。而且與RAPD、SSR、SRAP、AFLP、SNP等分子標(biāo)記技術(shù)相比，同工酶標(biāo)記技術(shù)具有成本較低、易于操作等特點(diǎn)。在品種分類研究方面，賈元義等( 2005)曾利用過氧化物同工酶對18個現(xiàn)代月季園藝品種進(jìn)行測定，共檢測出8條酶帶，并基于酶帶聚類分析將供試材料分成了5大類。然而，利用該酶對月季種質(zhì)資源親緣關(guān)系及雜種真實(shí)性鑒定的研究還未見報道。本研究通過對41份月季種質(zhì)資源的過氧化物酶( POD)分析，探討了野生種間及野生種和古老月季間的親緣關(guān)系，并對2個雜交組合的雜交后代進(jìn)行早期鑒定，為薔薇屬的系統(tǒng)關(guān)系、種質(zhì)鑒定和資源的有效利用提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

實(shí)驗(yàn)選用的41份材料包括12個野生種、15個古老月季及14個現(xiàn)代月季栽培品種均取自深圳市公園管理中心月季種質(zhì)資源保存圃(表1)。根據(jù)形態(tài)特征和文獻(xiàn)資料確定材料的準(zhǔn)確性( Ku＆Robertson，2003; Cairns，2007;張佐雙和朱秀珍，2006)。

1．2酶液制備、凝膠板制作、電泳及染色

取待試材料的新鮮幼嫩葉片，洗凈，瀝干，稱取0．5 g于研缽中，加入少許石英砂，混合0．05 mol· L-1，pH7．8的磷酸緩沖液1．5 mL冰浴研磨成勻漿。10 000 r·min-14℃離心20 min，取上清液，分裝在1 mL的Eppendorf管中，于－20℃冰箱中冷凍保存(胡能書和萬賢國，1985)。

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，電泳裝置采用DYY-6C型電泳儀，DYCZ-24EN型電泳槽(北京市六一儀器廠)。電極緩沖液為pH8．3的Tris-甘氨酸，酶加樣量為20 μL，分離膠濃度為7．2%，濃縮膠濃度為3．1%。穩(wěn)壓電泳，濃縮膠100 V，分離膠200 V，電泳4．5 h左右(胡能書和萬賢國，1985;何忠孝和張樹政，1999)。

表1　實(shí)驗(yàn)材料Table 1　Materials used in this study

采用抗壞血酸-聯(lián)苯胺法染色(胡能書和萬賢國，1985)，室溫染色至出現(xiàn)清晰的條帶后，用7%冰醋酸脫色，選取譜帶最清晰、整齊的膠板拍照做進(jìn)一步分析。

1．3數(shù)據(jù)處理

染色后凝膠譜帶顏色的深淺反映同工酶活性的強(qiáng)弱。根據(jù)顏色深淺程度將酶活性劃分為強(qiáng)、中、弱3個等級。利用BandScan 5．0軟件按譜帶分布計(jì)算電泳遷移率( Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離)，參考酶活性等級繪制酶譜模式圖。

將穩(wěn)定出現(xiàn)條帶的有或無量化為1和0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，形成0，1矩陣。采用NTSYSpc 2．1分析軟件計(jì)算樣品之間的Nei氏相似性系數(shù)( genetic similarity coefficient，GS)，利用非加權(quán)平均法( unweighted pairgroup method with arithmetic means，UPGMA)進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)樹(李強(qiáng)棟等，2012;王玉榮等，2013)。

2　結(jié)果與分析

2．1野生種與古老月季的過氧化物酶酶譜特征

圖1　27份月季種質(zhì)的POD酶譜　試驗(yàn)材料編號見表1，下同。Fig．1　POD photograph of 27 rose germplasm　Material names are listed in table 1，the same below．

圖2　27份月季種質(zhì)的酶譜模式圖Fig．2 Ideogram of 27 rose germplasm

12個薔薇原種及15個古老月季的POD同工酶酶譜及模式圖見圖1～2。不同材料之間在酶帶數(shù)、遷移率及酶活性方面差異明顯。27份月季種質(zhì)的POD同工酶共顯示了7條酶帶，這與賈元義等( 2005)對該屬材料進(jìn)行POD同工酶研究所獲得的酶帶數(shù)基本一致。對獲得的酶帶分別標(biāo)記為a、b……g，酶帶最少的是金櫻子( No．12)。這個材料中未檢測到POD酶帶;最多的是無刺薔薇( No．6)和‘湖中月’( No．19)，為5條;其余材料的酶帶數(shù)在1～4之間。

根據(jù)酶帶的相對遷移率及其分布特點(diǎn)把酶譜分為2個酶帶區(qū)(表2)，分別為A區(qū)( Rf = 0．264～0．650)，B區(qū)( Rf = 0．858)，A區(qū)包括a～f六條帶，B區(qū)只有g(shù)一條帶。其中a、b為野生種所特有，e、f為古老月季特有，c、d、g為所有材料的共有酶帶，d除了無刺薔薇具有外，其他野生種都無此帶。在A區(qū)的a帶，除碩苞薔薇、樟味薔薇、玫瑰、金櫻子( No．1，2，11，12)，b帶除樟味薔薇、玫瑰、金櫻子( No．2，11，12)，其余野生種均有檢測出。所有古老月季都具有g(shù)帶，‘軟香紅’等( No．13～15，18～20，24，25) 8個品種具e、f帶。

2．2現(xiàn)代月季雜交親本與后代的酶譜特征

雜交親本與后代的過氧化物同工酶酶譜特征見圖3。在3個雜交組合中，‘五月天’( C2)與藤‘墨紅’( C1)比較無特征酶帶，二者雜交后代‘香粉蝶’( C12-1)的酶譜與雙親差異明顯，酶帶在各處的酶活性都很強(qiáng)，以至于連成一條粗線;‘粉風(fēng)鈴’( C12-2)中未檢測到與雙親不同的酶帶?！獠省? C4)與‘白雪山’( C3)比較具有一條特征酶帶，其雜交后代C34-1、C34-2、C34-3也都具有父本的特征帶?！t霞’( C6)與‘戴高樂’( C5)相比具有兩條特有酶帶，雜交后代中C56-1具有一條父本的特有帶，C56-2具有一條父本特有帶的同時卻未檢測到父母本的兩條共有帶，C56-3不具有父本的特征帶，且酶帶與母本完全一致。

表2　月季種質(zhì)的酶譜遷移率Table 2　Rf value of the studied materials

圖3　雜交組合及后代的POD酶譜　箭頭示與母本相比，父本的特征酶帶。Fig．3 POD photograph of hybrid combinations and theirprogenies　Arrows refer to specific enzyme bands of male parents．

2．3聚類分析

將27份月季種質(zhì)材料的POD同工酶酶譜特征轉(zhuǎn)化成二元屬性數(shù)據(jù)，通過NTSYSpc 2．1軟件計(jì)算得到遺傳相似性系數(shù)( GS)，為0～1(表3)。表3表明其遺傳多樣性豐富，親緣關(guān)系遠(yuǎn)近各異。其中，香水月季與巨花薔薇、懸鉤子薔薇，粉紅香水月季與光葉薔薇、竹葉薔薇，樟味薔薇與玫瑰、‘映日荷花’‘月月紅’‘月月粉’之間的GS最大，親緣關(guān)系近。光葉薔薇、竹葉薔薇分別與古老月季中的‘玉玲瓏’‘大富貴’及‘一品朱衣’間的GS最小，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其他材料的GS在0．143～0．857之間。

采用UPGMA法對27份材料進(jìn)行聚類分析，得到聚類樹狀圖(圖4)。以相似系數(shù)0．57為閾值，供試的27份種質(zhì)被分為3個大組。第一組包括除樟味薔薇、玫瑰及金櫻子外的所有野生種，組內(nèi)以相似系數(shù)為0．86為閾值，香水月季、粉紅香水月季、巨花薔薇、懸鉤子薔薇，光葉薔薇及竹葉薔薇分別聚在一起，上述材料與無刺薔薇在0．81處聚為一個分支。第二組包括7個古老月季與樟味薔薇、玫瑰與金櫻子，在相似系數(shù)為0．83處，金櫻子與其他材料分離開來。其余古老月季材料聚為第三組，其中，‘軟香紅’‘四面鏡’和‘春水綠波’‘玉玲瓏’‘大富貴’和‘一品朱衣’分別在相似系數(shù)為1處聚在一起。

3　討論與結(jié)論

對酯酶( EST)和過氧化氫酶( CAT)進(jìn)行了研究，但這兩種酶活性較弱，不易被觀察。而過氧化物酶相對來說更加穩(wěn)定和清晰，且重復(fù)性好。類似情況在果樹和蓖麻中也有報道(王玉榮等，2013;晁無疾和牛淑珍，1981)，但在結(jié)縷草中卻有相反觀點(diǎn)(郭海林等，2006)。所以要根據(jù)所用材料來選擇合適的酶進(jìn)行分析，本研究表明薔薇屬植物采用過氧化物同工酶進(jìn)行分析研究具有一定的可行性。

野生種及古老月季的酶譜結(jié)果顯示不同材料在酶帶數(shù)、遷移率及酶活性差異明顯，表明供試材料具有豐富的遺傳多樣性，這與前人從形態(tài)( Rehder，1940; Ku＆Robertson，2003;張佐雙和朱秀珍，2006)、倍性(蹇洪英等，2010;張婷等，2010)及SSR(唐開學(xué)等，2008)等分子水平上研究得出的結(jié)論一致。聚類分析中巨花薔薇、香水月季及懸鉤子薔薇優(yōu)先聚類后再與粉紅香水月季、光葉薔薇及竹葉薔薇聚為一支，再之后又與無刺薔薇聚在一起。這一結(jié)果再次確認(rèn)了薔薇屬內(nèi)月季組與合柱組近緣( Matsumoto et al，1998; Jan et al，1999)。形態(tài)上，兩個組內(nèi)的材料都是托葉貼生，宿存，花柱外伸( Rehder，1940; Ku＆Robertson，2003)，區(qū)別僅在于月季組材料為離生花柱。這7個材料中有4個參與了現(xiàn)代月季的演化( Wylie，1954)，表明現(xiàn)代月季遺傳背景較窄( Matsumoto et al，1998)。值得注意的是，合柱組的另外一個材料粉團(tuán)薔薇和碩苞組的碩苞薔薇聚在了一起，此處的粉團(tuán)薔薇在之前研究得知由于種內(nèi)多倍化為三倍體材料(劉承源等，2008)，碩苞薔薇與其他月季種質(zhì)雜交高度不親和( Lewis＆Basye，1961)，此時兩個材料聚在一起，為雜交可行性提供了依據(jù)。雖然碩苞薔薇與金櫻子在形態(tài)上因都具有離生且脫落的托葉而被劃入一個大支中( Rehder，1940)，但本文中基于過氧化物同工酶分析卻被劃入兩個不同的大組中。實(shí)際上，碩苞薔薇的寬鋸齒狀托葉，花托及小枝被短柔毛( pubescent or woolly)等性狀都很容易區(qū)別于金櫻子。RAPD分析( Jan et al，1999)也認(rèn)為二者之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。所以，托葉離生、脫落這一性狀似乎是意味著二者之間的趨同進(jìn)化( convergence)，而不是共有衍征( synapomorphy) ( Wissemann＆Ritz，2005)。桂味組的玫瑰、樟味薔薇與古老月季聚為一組，表明他們在野生種向古老月季，以至現(xiàn)代月季品種的演化過程中起到了一定作用，這個結(jié)果也與唐開學(xué)等( 2008)的觀點(diǎn)基本一致。金櫻子和古老月季聚在一組同樣表明其作為雜交親本的可行性，這一觀點(diǎn)也在較早就被證實(shí):大花白木香( R．×fortuniana)就是由金櫻子和木香雜交而來( Crépin，1889; Matsumoto et al，2001)。我們在田間試驗(yàn)中應(yīng)用其作為父本與‘映日荷花’‘秋霞’‘歌林嬌紅’等古老月季和現(xiàn)代月季雜交都有結(jié)實(shí)，遺憾的是種子不能萌發(fā)，這可在以后的工作中結(jié)合幼胚拯救做進(jìn)一步研究。此外，供試古老月季聚為兩組，與野生種聚成的一組成并列關(guān)系，說明古老月季品種間的起源差異較大，和供試野生種，尤其是參與現(xiàn)代月季演化的月季組與合柱組材料之間的親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)，可以作為遠(yuǎn)緣雜交育種的親本材料。古老月季倍性豐富(蹇洪英等，2010;張婷等，2010)，可利用不同倍性材料與栽培品種雜交，從中獲得具有豐富染色體倍性和遺傳多樣性的雜交后代。

表3　27份月季種質(zhì)資源的POD同工酶遺傳相似性系數(shù)Table 3 POD genetic similarity coefficient of 27 rose germplasms resources

圖4　27份月季種質(zhì)的聚類分析圖Fig．4 Dendrogram of genetic relationship between the materials obtained with the UPGMA method

對雜種F1代的真?zhèn)舞b定參照前人(郭海林等，2006;谷麗佳等，2012)的研究方法對酶譜進(jìn)行分析: ( 1)父本與母本比較有特征帶，且后代也具有該特征帶; ( 2)父本與母本比較具有特征帶，但后代不具有該特征帶; ( 3)父本與母本比較沒有特征帶。第一種情況可鑒定后代為真是雜種，第二三種情況不能做出明確判斷，要具體分析。本試驗(yàn)的第1個雜交組合中兩個親本(‘墨紅’，‘五月天’)的酶帶特點(diǎn)屬于上述的第三種情況，其雜交后代‘香粉蝶’和‘粉風(fēng)鈴’是兩個獲得品種權(quán)的材料，如果是對這兩個材料按上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初次鑒定，其雜種真實(shí)性都不能確定。其余兩個雜交組合的雜交后代根據(jù)上述鑒定標(biāo)準(zhǔn)可推斷C34-1、C34-2、C34-3，C56-1、C56-2為真實(shí)雜種，C56-3應(yīng)為自交種。

由于受同工酶分子標(biāo)記的特點(diǎn)所決定，同工酶多有低估種間實(shí)際差異的傾向(張俊衛(wèi)和包滿珠，1998)。本試驗(yàn)表明過氧化物同工酶在分析種質(zhì)親緣關(guān)系時由于多態(tài)性位點(diǎn)的局限而略顯不足，但在雜種早期鑒定方面效果較好。因此，為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加精確，在研究植物材料物種之間的關(guān)系時，通過同工酶、核型分析及分子標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)技術(shù)互為補(bǔ)充，結(jié)合外部形態(tài)來進(jìn)行綜合分析，不失為一種交叉印證的可行方法。

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Genetic relationships and hybrids reality in rose germplasm based on POD isozyme

LIU Cheng-Yuan1，2，WANG Hui2，QIU Wen-Chang2，HE Heng-Hui2，F(xiàn)ANG Yan-Ming1*

( 1．Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China，College of Biology and the Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China; 2．Department of Horticulture，Shenzhen Park Service，Shenzhen 518040，China )

Abstract:In order to improve the utilization of germplasm resources，and to accelerate the process of rose breeding，peroxidase ( POD) isozyme patterns of 27 rose germplasm resources and 8 progenies of 3 hybrid combinations were studied with vertical polyacrylamide plate electrophoresis．The results showed that it had certain feasibility to do these researches with POD isozyme in Rosa．Three general enzyme bands and four specific enzyme bands at seven isozyme loci ( Rf from 0．264 to 0．858) were obtained according to zymogram analysis，which indicated the genetic diversity were abundant，but there were some homology among these materials．The 27 materials could be divided into three groups based on the UPGMA cluster a-book=115,ebook=120nalysis at the similar coefficient 0．57．According to the clustering results，materials from sections Synstylae and Indicae were clustered within one same group，the morphological similarity between these two sections was confirmed again based on our POD isozyme analyses．Whereas Rosa laevigata，and R．bracteata were separated in two different groups，which indicated that these two accessions were distantly related to each other．The samples of old garden roses used in this study were divided into two different groups，and in parallel with the group made of wild species，it indicated that large differences existed on the origin of these samples，which could be used for wide crosses in order to get hybrid offsprings with abundant genetic diversities．Furthermore，according to whether there were specific enzyme bands of male parent in the progenies，five of six hybrids among two hybrid combinations were initially identified as true ones，and the rest one was self-cross variety．These findings could offer basic data for further studies on genetic breeding of rose．

Key words:rose，POD，genetic relationship，hybrid identification，cluster analysis

作者簡介:劉承源( 1982-)，男，山東青島人，在讀博士研究生，工程師，研究方向?yàn)樵录痉N質(zhì)資源創(chuàng)新及遺傳育種，( E-mail) cyliu_1982@ 126．com。*通訊作者:方炎明，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)，( E-mail) jwu4@ njfu．edu．cn。

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金( 31370666) ;江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目( PAPD) ;深圳市城管局項(xiàng)目( 201008)［Supported by the National Science Foundation of China( 31370666) ; Priority Academic Program Development of Jiangsu High Education Institutions( PAPD) ; Project of Shenzhen Urban Management Bureau( 201008)］。

收稿日期:2014-11-27修回日期: 2015-03-18

DOI:10．11931/guihaia．gxzw201411039

中圖分類號:S685．12

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1000-3142( 2016) 01-0114-07