曹華蘋，吳道銘，甘海華，沈　宏

(華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣州510642 )

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鋁脅迫對擬南芥根尖AtPIN2蛋白表達活性的影響

曹華蘋，吳道銘，甘海華，沈宏*

(華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣州510642 )

摘要:鋁脅迫能影響根尖生長素的運輸，這與生長素運輸載體密切相關，PIN2作為根尖生長素的運輸?shù)鞍?，其獨特的組織定位可能誘導PIN2蛋白參與了鋁調(diào)節(jié)生長素的運輸過程。該研究以擬南芥PIN2缺失突變體( pin2)、PIN2□∷□GFP融合體及其野生型( WT)為材料，應用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，研究鋁處理對擬南芥根尖生長素運輸?shù)鞍譖IN2的表達活性、蛋白在組織及亞細胞水平分布及其對鋁內(nèi)置化作用的影響。結(jié)果表明:短期鋁處理或低鋁濃度能明顯增加擬南芥根尖細胞PIN2蛋白表達活性，而長期鋁處理或高鋁濃度抑制其表達活性;以100 μmol·L-1AlCl3處理4 h的蛋白表達活性最高。蛋白印跡反應發(fā)現(xiàn)，鋁處理促進PIN2蛋白在細胞膜上累積，減少胞內(nèi)囊泡中PIN2蛋白的含量;囊泡運輸抑制劑( BFA)能抑制鋁誘導PIN2蛋白的分配。鋁脅迫增加擬南芥根尖細胞H2O2累積，pin2的H2O2累積量大于WT，而相對根長小于WT。Morin染色結(jié)果顯示，pin2的鋁內(nèi)置化顯著小于WT。上述研究表明，PIN2蛋白在100 μmol·L-1AlCl3處理條件下活性最高，細胞膜累積程度加強，鋁內(nèi)置化能力增強，從而調(diào)節(jié)根系的生長發(fā)育。該研究結(jié)果進一步為鋁抑制生長素的運輸機制提供了理論基礎。

關鍵詞:鋁脅迫，擬南芥，AtPIN2，表達活性

曹華蘋，吳道銘，甘海華，等．鋁脅迫對擬南芥根尖AtPIN2蛋白表達活性的影響［J］．廣西植物，2016，36( 1) : 121－126

CAO HP，WU DM，GAN HH，et al．Effects of aluminum stress on the activity of PIN2 protein in Arabidopsis thaliana apical roots［J］．Guihaia，2016，36 ( 1) : 121－126

鋁毒是酸性土壤上限制農(nóng)作物生長重要的影響因子，植物響應鋁毒害的最初反應是根尖伸長受抑制( Delhaize＆Ryan，1995; Kochian et al，2004)。然而經(jīng)過多年研究，鋁抑制根尖伸長的確切機理尚未完全闡明( Ma et al，2014)。生長素的合成與運輸對根系伸長起了重要作用( Teale et al，2005)。根尖生長素在PIN蛋白家族(生長素輸出蛋白)的作用下，通過向頂運輸和向基運輸?shù)摹皞阈巍边\輸，形成根尖的生長素的不對稱分布，進一步影響根尖生長(吳道銘等，2014)。Laxmi et al( 2008)認為光照主要是通過調(diào)控PIN蛋白的細胞間的分布進而調(diào)控根系的生長。鋁脅迫能夠改變生長素的累積以及分布，并且，這個過程主要是通過生長素運輸載體AUX1 和PIN2調(diào)節(jié)( Yuan et al，2013)。在擬南芥根尖，PIN2蛋白定位于表皮細胞的頂端以及皮層細胞的底端，具有向基以及向頂?shù)纳L素運輸能力( Blilou et al，2005; Feraru＆Friml，2008 )。鋁與PIN2蛋白的相互關系并不清楚。

本研究以擬南芥PIN2基因缺失突變體( pin2)、對照野生型( WT)和PIN2□∷□GFP融合體為材料，研究了鋁脅迫對擬南芥根系生長、根尖PIN2蛋白表達活性及組織分布和PIN2蛋白對鋁內(nèi)置化的影響，以期初步探明鋁對PIN2蛋白影響的可能機制，為遺傳改良作物耐鋁性提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1試驗設計

供試擬南芥材料包括擬南芥( Arabidopsis thaliana) PIN2缺失突變體( pin2)、野生型( WT)及PIN2□∷□GFP融合體，分別來源于俄亥俄州立大學擬南芥生物資源中心和德國波恩大學細胞與分子植物研究所。在超凈工作臺內(nèi)，用滅菌牙簽將已消毒的種子均勻地播在1/4 MS培養(yǎng)基( pH 4．5，含1%葡萄糖)上，然后用Parafilm膜將培養(yǎng)皿密封。待播種完成后，將培養(yǎng)皿垂直放在光照培養(yǎng)箱中生長，生長條件為光照14 h，22℃;黑暗10 h，18℃;光照強度為150 μmol·m-2·s-1。試驗設置正常對照和鋁脅迫2個處理，即擬南芥種子播種在含有0或100 μmol·L-1AlCl3的1/4 MS培養(yǎng)基上生長6～7 d或14 d，然后取擬南芥幼苗根系進行顯微觀察和測定;或者先將擬南芥幼苗種在1/4 MS培養(yǎng)基上生長6 d，然后放在含有0或100 μmol·L-1AlCl3的0．2 mmol·L-1CaCl2的溶液中處理一段時間，隨后進行顯微觀察。

1．2試驗方法

鋁內(nèi)置化研究:將鋁處理后的擬南芥根系從培養(yǎng)基上輕輕取出，先放在0．2 mmol·L-1CaCl2溶液靜置5 min，清除根系表面的養(yǎng)分離子或其它雜物，然后放在濾紙上輕輕吸干根表水珠，隨后放在100 μmol·L-1的Morin染色液中靜置，并在減壓抽真空條件下放置10 min，以便染色液進入根系細胞內(nèi)部，隨后將根系在0．2 mmol·L-1CaCl2清洗2次后，用于激光共聚焦顯微鏡觀察。由于Morin熒光物質(zhì)能與鋁結(jié)合，在特定條件下發(fā)射熒光，根據(jù)熒光強度，即可判斷進入細胞內(nèi)鋁水平，即鋁的內(nèi)置化。

H2O2累積分析:利用根系細胞內(nèi)H2O2與熒光物質(zhì)H2DCF-DA結(jié)合的原理，將處理后的擬南芥根系放在50 μmol·L-1的2'，7'-二氯熒光素二乙酸鹽( 2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA)溶液中靜置處理，并在減壓抽真空條件下放置10 min，以便H2DCF-DA熒光物質(zhì)充分進入根系細胞內(nèi)，然后在0．2 mmol·L-1CaCl2溶液清洗2次，隨后放在激光共聚焦顯微鏡下觀察，熒光強度越強，表明H2O2含量越高。

激光共聚焦顯微觀察:擬南芥幼苗處理完畢后，取幼苗根系放置于載玻片上，加1滴去離子水，保持幼苗根尖浸泡在水中，再蓋上蓋玻片，置于激光共聚焦顯微鏡( Eclipse 800，日本)下觀察，其中，激發(fā)波長為488 nm，Argon激光( 1．4 mW)觀察。獲取典型照片作為該文結(jié)果。

圖1　鋁脅迫對擬南芥根系生長的影響　A．擬南芥在正常生長條件下照片; B．擬南芥在鋁脅迫條件下照片; C．擬南芥主根長; D．擬南芥相對根長。數(shù)據(jù)為均值±標準誤差( n=10)，柱子上字母不同表示不同處理差異達到顯著水平( P＜0．05)。下同。Fig．1　Effects of Al stress on root growth of Arabidopsis seedlings A．The control ( CK) ; B．100 μmol·L-1AlCl3; C．Length of tap root; D．Relative root elongation．The data were means±SE ( n=10)．Different letters indicate significantly differences at P＜0．05 level．The same below．

蛋白印跡反應:先將擬南芥幼苗種在培養(yǎng)基上生長13～14 d，然后將其轉(zhuǎn)入分別含有0 μmol·L-1AlCl3，20 μmol·L-1BFA，100 μmol·L-1AlCl3或20 μmol·L-1BFA + 100 μmol·L-1AlCl3的0．2 mmol· L-1CaCl2溶液中處理2 h，處理完畢后，收獲根尖1 cm的根段，用Phase-Partitioning方法提取根系質(zhì)膜膜蛋白和囊泡蛋白。質(zhì)膜蛋白和囊泡蛋白先溶解在SDS-loading緩沖液中，緩沖液含有0．125 mmol·L-1Tris-HCl，pH7．4，10%SDS，10%甘油及二硫蘇糖醇、溴酚蘭、苯甲磺酰氟化物。經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)入去氟PVP膜片上，進行雜交反應。用抗玉米多克隆抗體與膜片雜交，抗血清溶液用Tris緩沖液+Tween按1∶1 000稀釋使用，二次抗體檢測用BCIP-NPT方法進行檢測。

1．3數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2003和SAS 9．2軟件分析，用Duncan法進行檢驗( P＜0．05)。

2　結(jié)果與分析

2．1鋁脅迫對擬南芥根系生長的影響

圖1為擬南芥在正常生長和鋁脅迫條件下的長勢。無論正常生長或鋁脅迫處理條件下，pin2根系均呈彎曲生長，這可能與PIN2基因缺失、生長素極性輸出受阻，根系向地性缺失有關;而WT的根系在正常和鋁脅迫條件下均垂直向下生長，具有明顯的向地性。有趣的是，pin2在鋁脅迫下向地性缺失現(xiàn)象沒有正常生長條件下那么嚴重(圖1: A，B)。利用直尺測定擬南芥根長，發(fā)現(xiàn)在鋁脅迫條件下，WT的主根根長以及相對根長均顯著大于pin2 (圖1: C，D)，表明pin2的耐鋁性小于WT。

2．2鋁脅迫對擬南芥根系H2O2累積的影響

植物根系在鋁脅迫下，容易遭受氧化脅迫( Yamamoto et al，2002，2003)。熒光物質(zhì)H2DCF-DA 與H2O2結(jié)合，熒光越強指示H2O2累積更多。圖2顯示，100 μmol·L-1Al處理可明顯增加pin2和WT根尖熒光亮度，其中pin2的熒光強度較強;相對熒光強度的結(jié)果與上述結(jié)果一致。表明鋁處理可明顯增加H2O2的累積，且pin2的H2O2累積可能高于WT。尤其是兩材料根系維管束的熒光強度明顯高于其它部位，且根尖、過渡區(qū)和伸長區(qū)的細胞熒光強度明顯高于根系成熟區(qū)細胞。

2．3鋁對PIN2□∷□GFP表達活性的影響

圖2　鋁脅迫處理對擬南芥根尖細胞H2O2累積的影響　A．正常生長; B．鋁脅迫處理; C．H2O2相對熒光強度。數(shù)據(jù)為均值±標準誤差( n=3)。Fig．2 Effects of Al on H2O2accumulation in Arabidopsis roots A．CK; B．100 μmol·L-1AlCl3; C．Relative fluorescence intensity of H2O2．The data are means±SE ( n=3)．

圖3　不同鋁處理濃度和時間對PIN2□∷□GFP表達活性的影響　A．不同鋁處理濃度(μmol·L-1，4 h) ; B．不同鋁處理時間( 100 μmol·L-1，h)。Fig．3 Effects of Al concentrations and durations on PIN2□∷□GFP activity in apical rootsA．Different Al concentrations for 4 h; B．Different Al durations ( 100 μmol·L-1AlCl3，h)．

上述結(jié)果顯示，PIN2蛋白可能參與了擬南芥的耐鋁反應。為明確其內(nèi)在機制，利用PIN2□∷□GFP材料，進一步研究了鋁脅迫對PIN2蛋白表達活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PIN2□∷□GFP表達活性主要在擬南芥根系的根尖細胞(如分生區(qū)、過渡區(qū)和伸長區(qū)細胞)表達，成熟區(qū)PIN2□∷□GFP表達活性明顯低于根尖細胞。在一定的鋁處理濃度內(nèi)，PIN2□∷□GFP表達活性隨著鋁處理水平增加而逐步增加。當鋁處理濃度為100 μmol·L-1、處理時間為4 h時，PIN2□∷□GFP的活性達最高; 100 μmol·L-1鋁處理8 h，或者200 μmol·L-1鋁處理4 h，根尖PIN2□∷□GFP活性下降(圖3)。

2．4鋁對擬南芥根尖細胞PIN2□∷□GFP蛋白累積的影響

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，正常生長時，PIN2□∷□GFP囊泡蛋白在根尖細胞內(nèi)形成的點狀結(jié)構(gòu)數(shù)量多，但點狀結(jié)構(gòu)的大小較少，明顯小于鋁脅迫條件下形成的點狀結(jié)構(gòu)。鋁脅迫處理后( 100 μmol·L-1)，PIN2□∷□GFP蛋白在細胞膜水平方向上累積較強的熒光，表明鋁脅迫誘導了較多的PIN2蛋白向細胞膜水平方向累積。

2．5鋁對擬南芥PIN2蛋白在細胞膜與細胞膜內(nèi)分配的影響

蛋白印跡反應通過蛋白質(zhì)與抗體雜交反應，能較好指示蛋白的表達水平。利用該方法，我們研究了BFA和鋁脅迫對PIN2蛋白表達與分配的影響。圖5結(jié)果顯示:與對照( CK)相比，BFA處理以及Al +BFA處理對PIN2蛋白在細胞膜與細胞膜內(nèi)的分配沒有明顯影響，然而100 μmol·L-1AlCl3處理有增加PIN2蛋白向細胞膜分配的趨勢。上述結(jié)果表明BFA有抑制鋁誘導PIN2蛋白在細胞膜上累積的現(xiàn)象。結(jié)合圖4和圖5的結(jié)果可以看出，鋁脅迫處理不僅影響PIN2蛋白表達，還對PIN2囊泡蛋白的分配有調(diào)節(jié)作用。

圖4　鋁脅迫處理對擬南芥根尖細胞PIN2□∷□GFP累積的影響　A．正常生長; B．鋁脅迫處理。Fig．4 Effects of Al stress on PIN2□∷□GFP protein accumulation in apical roots of Arabidopsis seedlings A．The control ( CK) ; B．100 μmol·L-1AlCl3．

圖5　PIN2蛋白在細胞膜和囊泡之間的分布　CK．正常生長條件; BFA．20 μmol·L-1BFA; Al．100 μmol·L-1AlCl3; Al+BFA．20 μmol·L-1BFA + 100 μmol·L-1AlCl3。Fig．5　Distribution of PIN2 protein in tissues between plasma membrane and endosomes of cells　CK．The control ( CK) ; BFA．20 μmol·L-1BFA; Al．100 μmol·L-1AlCl3; Al+ BFA．20 μmol·L-1BFA + 100 μmol·L-1AlCl3．

2．6鋁脅迫對擬南芥根尖細胞鋁內(nèi)置化的影響

Morin是一種能與鋁結(jié)合的熒光物質(zhì)，進入細胞后與鋁結(jié)合，可指示細胞內(nèi)鋁的分布和累積情況。本實驗利用Morin的這種特性，研究了鋁脅迫下pin2和WT根尖細胞的鋁內(nèi)置化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pin2根尖的Morin熒光物質(zhì)主要分布在質(zhì)外體的細胞間隙(圖6: A)，而野生型WT的根尖細胞質(zhì)中明顯存在類似囊泡結(jié)構(gòu)的熒光物質(zhì)，但在質(zhì)外體空間的熒光亮度較低(圖6: B)。表明pin2材料累積的鋁主要分布在質(zhì)外體如細胞壁和細胞膜上，而WT累積的鋁主要分布在細胞膜內(nèi)。PIN2基因缺失可能減弱了鋁從細胞壁或細胞膜向細胞內(nèi)的運輸，說明PIN2基因可能調(diào)節(jié)了細胞壁和細胞膜上累積的鋁向細胞內(nèi)運輸，具體調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。

3　討論與結(jié)論

植物根系的生長和發(fā)育是一個復雜的生物學過程。生長素，細胞分裂素和赤霉素等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物根系的形態(tài)建成意義重大。其中生長素的合成，運輸和信號傳導在根系生長發(fā)育中發(fā)揮了重要作用( Saini et al，2013)。根尖是植物鋁毒脅迫的主要位點，鋁毒能迅速抑制根尖伸長。早期的研究發(fā)現(xiàn)，鋁會影響擬南芥根尖PIN2蛋白的囊泡運輸，進而破壞生長素的極性運輸，最終抑制了根系生長( Shen et al，2008)。本研究通過比較鋁脅迫對pin2和WT根系生長的影響，發(fā)現(xiàn)鋁處理條件下pin2相對根長小于WT。H2O2的熒光染色結(jié)果還表明鋁脅迫增加擬南芥根尖細胞H2O2累積，pin2的H2O2累積量大于WT。這說明對于鋁毒害，PIN2基因缺失突變體比其對照野生型更敏感，也表明PIN2基因與鋁耐性有關。

圖6　兩個擬南芥材料根尖細胞鋁內(nèi)置化　A．pin2; B．WT。箭頭指示鋁的內(nèi)置化。Fig．6　Al internalization in apical cells of Arabidopsis seedlings A．pin2; B．WT．Arrow indicates Al internalization in the cells．

Abas et al( 2006)研究PIN2蛋白介導的根向地性發(fā)現(xiàn)，在重力刺激下，無論是用內(nèi)源啟動子還是異源啟動子，PIN2蛋白在根上、下部都會形成不平衡分布，其上部有更多的PIN2蛋白被降解，表明PIN2重新排布是由于轉(zhuǎn)錄后水平導致的。pin2突變體中PIN2蛋白重新分布和降解受到干擾，生長素的分配被破壞，造成根向重力性表型缺失。光照能夠調(diào)節(jié)PIN2蛋白的囊泡運輸，促進定位于細胞質(zhì)膜，進而影響根系生長( Laxmi et al，2008; Yokawa et al，2014)。本研究利用激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果表明，100 μmol·L-1鋁處理4 h能誘導最高的PIN2□∷□GPF蛋白表達活性，并且鋁脅迫誘導了較多的PIN2蛋白向細胞膜水平方向累積。本研究蛋白印跡反應還進一步表明，鋁處理促進PIN2蛋白在細胞膜上累積，減少胞內(nèi)囊泡中PIN2蛋白的含量，而囊泡運輸抑制劑( BFA)能抑制鋁誘導PIN2蛋白的分配。這暗示鋁脅迫可能通過影響PIN2蛋白的分配，從而影響根系內(nèi)部生長素運輸，最終影響根尖伸長。

值得一提的是，本研究借助Morin染色，發(fā)現(xiàn)在細胞內(nèi)WT累積的鋁明顯比pin2的多。這表明PIN2基因缺失可能影響了鋁的內(nèi)置化。根尖過渡區(qū)是最先接觸鋁，同時又是對鋁最敏感的區(qū)域( Sivaguru＆Horst，1998; Sivaguru et al，1999)。在這個區(qū)域存在較高頻率的內(nèi)吞循環(huán)過程，并且鋁內(nèi)置化過程與內(nèi)吞運輸相關( Illé?et al，2006)。而在擬南芥中PIN2蛋白主要定位于這個區(qū)域，通過高頻率的內(nèi)吞運輸來完成質(zhì)膜與細胞內(nèi)部之間循環(huán)進一步運輸生長素( Geldner et al，2003; Baluska et al，2005，2010)。這暗示生長素運輸?shù)鞍卓赡苤苯咏Y(jié)合鋁，借助生長素向胞內(nèi)運輸途徑將鋁轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，這樣原本結(jié)合在細胞壁或細胞膜上的鋁可能借助囊泡的運輸，通過“搭便車”的方式內(nèi)吞進入細胞內(nèi)部( Panda et al，2009)。但具體調(diào)節(jié)機制還在進一步研究中?？傊?，本研究表明，PIN2基因參與了鋁脅迫的響應，PIN2蛋白在鋁運輸及鋁對生長素運輸過程中發(fā)揮重要作用。

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Effects of aluminum stress on the activity of PIN2 protein in Arabidopsis thaliana apical roots

CAO Hua-Ping，WU Dao-Ming，GAN Hai-Hua，SHEN Hong*

( College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China )

Abstract:There is closely relationship between Al-influenced auxin transport and auxin transporter．PIN2 is an auxin efflux carrier protein，it unique localization may responses to Al-influenced auxin transport．In this study，using pin2，PIN2□∷□GFP and WT as experimental materials，the effects of Al stress on PIN2 protein activity，distribution and Al internalization were investigated with confocal laser scanning microscope．The results indicated that short-term Al treatment or low Al level increased the activity of PIN2 protein in apical cells of Arabidopsis seedlings，while long-term Al treatment or high Al levels inhibited it．The activity of PIN2 protein reached the maximal value in response to 100 μmol·L-1Al for 4 h．The results from Western-blotting analysis indicated that Al enhanced the accumulation of PIN2 protein on cell membrane，while decreased it in vesicles．Brefeldin A ( BFA)，an inhibitor of vesicle transport suppressed Al-induced allocation of PIN2 protein．On the other hand，Al stress could increase the accumulation of H2O2in apices．pin2 had a higher H2O2accumulation and a lower relative root elongation than WT．And the results from Al-Morin stai-book=122,ebook=127ning analysis indicated that pin2 had a lower Al internalization than WT．Taken together，the above results suggested that 100 μmol·L-1Al induced the highest activity of PIN2 protein，and enhanced its accumulation in horizontal direction of plasma membrane and Al internalization，thus mediated root growth．The results would provide scientific basis for elucidating Al-influenced auxin transport．

Key words:aluminum stress，Arabidopsis thaliana，AtPIN2，expression activity

*通訊作者:沈宏，博士，教授，博士生導師，主要從事植物根層調(diào)控原理與技術(shù)研究，( E-mail) hshen@ scau．edu．cn。

作者簡介:曹華蘋( 1991-)，女，江西上饒人，碩士研究生，主要從事鋁毒害相關研究，( E-mail) caohuaping1991@ 163．com。

基金項目:國家自然科學基金( 31172026，31372125)［Supported by the National Natural Science Foundation of China( 31172026，31372125)］。

收稿日期:2014-12-30修回日期: 2015-03-31

DOI:10．11931/guihaia．gxzw201412052

中圖分類號:Q945．78

文獻標識碼:A

文章編號:1000-3142( 2016) 01-0121-06