朱玲, 程金建, 許玲玉，楊華

(1廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021； 2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院)

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鼻咽癌CNE1放射抗拒細(xì)胞亞系CNE1/70R與親代細(xì)胞的差異

朱玲1, 程金建2, 許玲玉1，楊華1

(1廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021； 2廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院)

摘要：目的探討鼻咽癌CNE1細(xì)胞及放射抗拒細(xì)胞亞系CNE1/70R細(xì)胞在倍增時(shí)間、放射敏感性、藥物敏感性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期方面的差異。方法用臨床常規(guī)分割根治劑量70 Gy體外照射建立鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞模型CNE1/70R。采用生長(zhǎng)曲線檢測(cè)CNE1及CNE1/70R兩株細(xì)胞倍增時(shí)間，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞放射敏感性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物多西紫杉醇、順鉑的敏感性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期的變化。結(jié)果CNE1/70R和CNE1細(xì)胞的倍增時(shí)間分別為(1.612±0.069)、(1.481±0.046)d；與CNE1細(xì)胞比較，CNE1/70R細(xì)胞的放射抗拒性增強(qiáng)，對(duì)化療藥物多西紫杉醇和順鉑敏感性增高；細(xì)胞經(jīng)照射后，CNE1細(xì)胞G2/M期阻滯較CNE1/70R細(xì)胞更加明顯；細(xì)胞經(jīng)照射相同劑量后，CNE1細(xì)胞凋亡率高于CNE1/70R細(xì)胞。以上觀察指標(biāo)比較，兩株細(xì)胞差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。結(jié)論成功建立人鼻咽癌放射抗拒株CNE1/70R，且與親代細(xì)胞在放射及藥物治療敏感性方面有穩(wěn)定差異。

關(guān)鍵詞：鼻咽腫瘤；放射敏感性；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期；多西紫杉醇；順鉑

鼻咽癌是我國(guó)南方地區(qū)的一種常見惡性腫瘤。由于其特殊的病理類型、生物學(xué)行為和解剖結(jié)構(gòu)，放射治療(放療)仍是首選的治療方法。然而單純放療的鼻咽癌患者5年生存率約為 50%，其治療失敗的原因之一是鼻咽癌組織中存在一定比例對(duì)放射線有抗拒作用的細(xì)胞[1]。目前，國(guó)內(nèi)外已成功地運(yùn)用輻射誘導(dǎo)建立起放射抗拒的人腦膠質(zhì)瘤、纖維肉瘤等對(duì)比研究模型[2,3],并對(duì)這些細(xì)胞株作放射抗拒機(jī)制的初步研究。2014年8月～2015年11月，我們建立鼻咽癌CNE1細(xì)胞及放射抗拒細(xì)胞亞系CNE1/70R，為探討鼻咽癌放射抗拒的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料人鼻咽癌CNE1細(xì)胞由中科院上海生物學(xué)研究所提供，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液中。多西紫杉醇、順鉑購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品。細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)于BD公司。放射源為X射線。用臨床常規(guī)分割根治劑量70 Gy(6 MV X線，70 Gy/35 d，2 Gy/d，1次/d，5次/周)體外照射建立鼻咽癌放射抗拒細(xì)胞模型CNE1/70R。

1.2 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線取CNE1、CNE1/70R對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，以l×104/mL的密度常規(guī)培養(yǎng)于24孔板中，每孔1 mL，每日取其中的3孔用胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。連續(xù)觀察及計(jì)數(shù)7 d，重復(fù)3次。以培養(yǎng)時(shí)間為X軸、細(xì)胞數(shù)目為Y軸繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.3照射細(xì)胞克隆形成觀察取CNE1、CNE1/70R對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)、稀釋，分別接種不同數(shù)目于6孔板中，根據(jù)接種的細(xì)胞數(shù)分別給0、1、2、3、4、6、8 Gy照射；照射后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2周，甲醇固定、吉姆薩染色，計(jì)數(shù)形成的集落數(shù)。結(jié)果通過(guò)Graph pad6.0軟件采用單擊多靶模型處理，模型方程為SF2=1-(1-e-D/D0)×N。

1.4藥物對(duì)兩組細(xì)胞的抑制作用檢測(cè) 采用MTT比色法。細(xì)胞按密度為2×104/mL加入96孔板，每孔200 μL。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入稀釋后的多西紫杉醇、順鉑。順鉑濃度為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL，多西紫杉醇濃度為1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔總體積200 μL，1個(gè)空白對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出上清培養(yǎng)基，每孔再加入DMSO 150 μL，輕微振蕩溶解結(jié)晶。于490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的吸光度(OD值)。

1.5細(xì)胞周期檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。將兩組細(xì)胞接種于6孔板中，分別采用0、8 Gy照射，照射24 h后收集細(xì)胞用PBS 洗滌、離心2次，加入PI染色液0.5 mL，冰上避光染色 15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.6細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)。取兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板中，分別采用0、4、8、12 Gy照射48 h收集細(xì)胞，每樣本為1×106/mL。PBS洗滌、離心2次，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和5 μL的 PI，避光室溫反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞接種24 h后已基本貼壁。CNE1/70R細(xì)胞生長(zhǎng)速度較親代細(xì)胞CNE1慢,CNE1和CNE1/70R細(xì)胞的倍增時(shí)間分別為 (1.481±0.046)、(1.612±0.069)d,放射抗拒細(xì)胞株較親代延長(zhǎng)(P<0.05)。見圖1。

圖1　CNE1及CNE1/70R細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.2兩組細(xì)胞克隆形成情況CNE1細(xì)胞放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq、N、SF2 分別為2.930、0.206、1.073、0.482，CNE1/70R細(xì)胞分別為2.940、1.084、1.488 、0.612。D0、 Dq、N、SF2越大，放射抗拒性越大， CNE1/70R細(xì)胞放射抗拒性增強(qiáng)(P<0.05)。

2.3藥物對(duì)兩組細(xì)胞的抑制作用不同濃度多西紫杉醇、順鉑作用細(xì)胞48 h 后,多西紫杉醇對(duì)CNE1和CNE1/70R細(xì)胞的IC50分別為0.049、0.001 μmol/L。順鉑對(duì)CNE1和CNE1/70R細(xì)胞的IC50分別為1.008、0.337 μg/ mL,CNE1/70R細(xì)胞較親代細(xì)胞CNE1對(duì)多西紫杉醇和順鉑更加敏感。見表1。

2.4兩組細(xì)胞周期分布細(xì)胞照射后均出現(xiàn)G2/M期阻滯，CNE1 細(xì)胞的G2/M期阻滯是CNE1/70R的1.36倍，CNE1/70R細(xì)胞的G2/M期阻滯程度低于CNE1細(xì)胞。詳見表2。

表1　不同濃度多西紫杉醇、順鉑對(duì)兩組細(xì)胞的

注：與CNE1/70R組相同濃度比較,*P<0.05。

表2　CNE1及CNE1/70R細(xì)胞經(jīng)照射后細(xì)胞

注：與CNE1/70R組相同照射劑量比較，*P<0.05。

2.5不同照射劑量照射兩組細(xì)胞凋亡情況CNE1及CNE1/70R細(xì)胞分別照射0、4、8、12 Gy，48 h后，隨劑量增加，兩株細(xì)胞凋亡率增加，相同照射劑量下，CNE1/70R細(xì)胞凋亡率低于CNE1細(xì)胞。詳見表3。

表3　不同照射劑量?jī)山M細(xì)胞凋亡率比較±s)

注：與CNE1/70R組同照射劑量比較,*P<0.05。

3討論

腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的存在使得同一來(lái)源的腫瘤組織細(xì)胞表現(xiàn)出多樣的生物學(xué)特性，同一細(xì)胞群中存在放射敏感亞群和抗拒亞群，因此在射線間歇性反復(fù)照射過(guò)程中，敏感的細(xì)胞被射線殺滅，抗拒的細(xì)胞則存活并繼續(xù)增殖，由此篩選出放射抗拒細(xì)胞系CNE1/70R。應(yīng)用集落形成實(shí)驗(yàn)對(duì)其放射抗拒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，存活曲線以及相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)D0、Dq、N、SF2均提示CNE1/70R細(xì)胞較其親代細(xì)胞更具放射抗拒性。

有研究表明，凋亡與放射敏感性之間具有重要的指示關(guān)系。 Mitsubashi等[4]發(fā)現(xiàn),在整個(gè)細(xì)胞群體中,照射后以凋亡形式死亡的細(xì)胞所占比例越大,其放射敏感性越高,這是衡量放射敏感性的重要指標(biāo)。Broaddus等[5]在實(shí)驗(yàn)中將腺病毒介導(dǎo)的wtp53轉(zhuǎn)染至含有mtp53的惡性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤,也顯示在輻射敏感性增強(qiáng)的同時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多。因此，放射敏感性是影響凋亡至關(guān)重要的因素之一。本結(jié)果顯示CNE1/70R細(xì)胞凋亡率低于CNE1細(xì)胞，提示著CNE1/70R放射抗拒性較親代細(xì)胞增強(qiáng)。

有研究表明，處在不同細(xì)胞周期的細(xì)胞對(duì)放射的敏感性不同[6，7]。處于 S期的腫瘤細(xì)胞對(duì)射線最不敏感，G1期較為敏感，而G2期的細(xì)胞最為敏感。不敏感細(xì)胞比例增加，使得細(xì)胞在射線照射時(shí)更有可能表現(xiàn)抗拒性[8]。因此改變腫瘤細(xì)胞周期可影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[9]，本研究中，射線照射后CNE1/70R細(xì)胞G2/M期阻滯程度不如CNE1細(xì)胞明顯，S期細(xì)胞比例相對(duì)高于CNE1細(xì)胞，提示CNE1/70R細(xì)胞較其親代細(xì)胞更具放射抗拒性。

化療藥物主要是通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞、引起腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮治療作用。順鉑是一種臨床上常用的化療藥物，該藥通過(guò)將細(xì)胞周期阻斷在 G2/M 期來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，其中包括了鼻咽癌細(xì)胞。多西紫杉醇是一種新型半合成紫杉醇類衍生物,為有絲分裂抑制劑,可通過(guò)促進(jìn)微管蛋白聚合及抑制解聚,保持微管蛋白穩(wěn)定,使細(xì)胞分裂終止于G2/M期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。順鉑、多西紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用與腫瘤細(xì)胞 G2/M期阻滯及放療抵抗的乏氧細(xì)胞再氧合[10]有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧達(dá)到一定水平后也可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡甚至壞死。因此，通過(guò)化療藥物有目的地改變細(xì)胞周期, 進(jìn)而增強(qiáng)放療敏感性對(duì)腫瘤治療有重要意義。

綜上所述，CNE1/70R細(xì)胞株與親代細(xì)胞株相比，在放射敏感性和藥物敏感性上都存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其放射抗拒機(jī)制可能與周期分布改變及細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Differences between radioresistant cell subline CNE1/70R of nasopharyngeal carcinoma CNE1 and its parental cell line

ZHULing1,CHENGJinjian,XULingyu,YANGHua

(1GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:Objective To investigate the differences in the doubling time, radiosensitivity, drug sensitivity, apoptosis and cell cycle distribution between nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells and radioresistant cell subline CNE1/70R. MethodsUsing a radical cure dose (70 Gy) of clinical routine segmentation in vitro irradiation to establish radioresistant nasopharyngeal carcinoma cell line model CNE1/70R. The doubling time of the two cell lines CNE1 and CNE1/70R was measured by cell growth curve. The radiobiological characteristics of the two cell lines were analyzed by the colony forming assay. MTT was used to test the drug sensitivity of the two cell lines to docetaxel and cisplatin. The apoptosis and cell cycle was analyzed by flow cytometry. ResultsThe doubling time of CNE1/70R and CNE1R cells was respectively (1.612±0.069) d and (1.481±0.046) d. The result of colony formation assay showed that the radioresistance of CNE1/70R cells was stronger than that of CNE1. Compared with CNE1 cells, CNE1/70R cells were more sensitive to the drugs. After irradiation, the CNE1 cells blocked in the G2/M phase were more than those of CNE1/70R cells, CNE1 arrested more obvious than CNE1/70R. After the same dose of irradiation, the apoptosis rate of CNE1 cells was higher than that of CNE1/70R cells. Significant differences were found in the above indexes between these two cell lines (all P<0.05). ConclusionsWe successfully establish radiaoresistant nasopharyngeal carcinoma cell subline CNE1/70R, and it has stable difference with its parental cell line in radiosensitivity and drug sensitivity.

Key words:nasopharyngeal neoplasms; radiosensitivity; apoptosis; cell cycle; docetaxel; cisplatin

(收稿日期：2015-10-26)

中圖分類號(hào)：R739.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)05-0016-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.006

通信作者簡(jiǎn)介：楊華(1977-),女，副教授，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)和放射生物學(xué)，主持省自然科學(xué)基金項(xiàng)目研究2項(xiàng)，申請(qǐng)專利1項(xiàng)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文多篇。E-mail：yanghuaz@163.com

作者簡(jiǎn)介：第一朱玲(1992-)，女，在讀碩士，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)和放射生物學(xué)。E-mail：592054762@qq.com

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFBA053106)； 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160284)。