牟天易 綜述，簡(jiǎn)華剛 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科　400010)

?

·綜述·

生物膜致慢性創(chuàng)面難以愈合的病理機(jī)制及其治療*

牟天易 綜述，簡(jiǎn)華剛△審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科400010)

生物膜；傷口愈合；慢性創(chuàng)面；病理機(jī)制

慢性創(chuàng)面(chronic wounds)是指機(jī)體正常皮膚及組織損傷后，因內(nèi)外因素作用，接受超過(guò)1個(gè)月的正規(guī)治療，而無(wú)法經(jīng)過(guò)及時(shí)、有序、正常的修復(fù)程序，達(dá)到解剖及功能上完整、無(wú)愈合傾向的創(chuàng)面[1-2]。臨床上常見(jiàn)慢性創(chuàng)面有糖尿病足潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、壓力性潰瘍、下肢靜脈潰瘍等。由于缺血缺氧、高血糖、失神經(jīng)等情況，慢性創(chuàng)面中具有先天免疫功能的表皮受損，皮下組織外露，具有濕潤(rùn)環(huán)境，豐富營(yíng)養(yǎng)，為細(xì)菌生物膜的形成提供理想環(huán)境。近年來(lái)，細(xì)菌生物膜的形成在慢性創(chuàng)面中所起的作用逐漸被重視，現(xiàn)代研究認(rèn)為，除了缺氧、缺血再灌注損傷和宿主內(nèi)在因素外,細(xì)菌生物膜的形成成為慢性創(chuàng)面難以愈合的主要障礙[3]。更加深入地了解細(xì)菌生物膜致慢性創(chuàng)面難愈合的機(jī)制及如何控制慢性化的惡性循環(huán)，將為慢性創(chuàng)面的治療提供方法。本文就生物膜定義、生物膜致慢性創(chuàng)面難以愈合的病理機(jī)制、生物膜的臨床治療作簡(jiǎn)要綜述。

1　生物膜的定義及生物膜存在于慢性創(chuàng)面

生物膜為微生物黏附于物體及活性組織表面或彼此黏附，包被于自身分泌的由蛋白質(zhì)、DNA、多糖等組成的細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar polymeric substance，EPS)，形成一個(gè)與其浮游狀態(tài)完全不同的生長(zhǎng)方式的群落，對(duì)宿主免疫系統(tǒng)及抗菌藥物治療形成天然抵抗，產(chǎn)生持續(xù)致病性的微生物聚集體[4]。生物膜是微生物針對(duì)不利環(huán)境形成的一種保護(hù)性生長(zhǎng)方式。James等[5]調(diào)查生物膜的存在時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有6%的急性創(chuàng)面發(fā)現(xiàn)生物膜，而60%的慢性創(chuàng)面中表現(xiàn)出生物膜的存在；這表明生物膜更多存在于慢性創(chuàng)面，而很少在急性創(chuàng)面，這可能與慢性創(chuàng)面難以愈合有關(guān)。創(chuàng)面生物膜的形成可能是創(chuàng)面慢性化的重要原因之一[3]；由于生物膜形成是細(xì)菌耐藥的機(jī)制之一[6]，慢性創(chuàng)面中細(xì)菌生物膜的形成可能與臨床上細(xì)菌多重耐藥有關(guān)；慢性創(chuàng)面中生物膜作為細(xì)菌的儲(chǔ)存庫(kù)，源源不斷地釋放出浮游細(xì)菌，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)，讓創(chuàng)面停滯于炎性反應(yīng)期，生物膜在延遲慢性創(chuàng)面愈合中起著重要作用[7-8]。

2　生物膜致慢性創(chuàng)面難以愈合的病理機(jī)制

急性創(chuàng)面愈合經(jīng)過(guò)凝結(jié)，炎性反應(yīng)期，增生性階段(肉芽組織形成)及再上皮化或重塑階段，重建皮膚結(jié)構(gòu)及功能的完整性；由于細(xì)菌生物膜不當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)創(chuàng)面炎癥細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、炎癥因子、細(xì)胞因子及pH值等，使慢性創(chuàng)面固定于炎性反應(yīng)期，無(wú)法成功地進(jìn)入增生性階段及再上皮化或重塑階段；由于生物膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，形成一個(gè)致密物理屏障，對(duì)抗菌藥物及免疫系統(tǒng)耐受，細(xì)菌生物膜難以被清除，持續(xù)存在于慢性創(chuàng)面，引起慢性創(chuàng)面出現(xiàn)持續(xù)低效應(yīng)炎性反應(yīng)。

2.1炎癥細(xì)胞慢性創(chuàng)面中生物膜的持續(xù)存在，生物膜內(nèi)的細(xì)菌及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)作為趨化因子，源源不斷地趨化和招募炎癥細(xì)胞至創(chuàng)面。在創(chuàng)面發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞是到達(dá)創(chuàng)面第一批炎癥細(xì)胞,通過(guò)消除細(xì)菌、異物、壞死組織,并釋放細(xì)胞因子促進(jìn)血管再生和肉芽組織的形成，有助于傷口愈合。然而,由于細(xì)菌生物膜致密的細(xì)胞外基質(zhì)，中性粒細(xì)胞難以大量滲透到生物膜內(nèi)部，即使部分滲透到生物膜周?chē)?，也難以對(duì)其發(fā)揮吞噬作用。在群體感應(yīng)系統(tǒng)作用下，各種細(xì)菌毒力因子的產(chǎn)生，抑制了中性粒細(xì)胞的活性；有報(bào)道稱(chēng)銅綠假單胞菌生物膜的群體感應(yīng)系統(tǒng)控制的毒力因子——鼠李糖脂,能引起中性粒細(xì)胞快速溶解[9]，致使生物膜難以被清除；中性粒細(xì)胞在感染部位持續(xù)的聚集，產(chǎn)生大量的溶細(xì)胞酶、活性氧、蛋白酶(彈性蛋白酶和金屬蛋白酶)。而低水平的活性氧作為胞內(nèi)信號(hào)的重要介質(zhì)可有效地促使創(chuàng)面愈合；不受控的活性氧釋放，導(dǎo)致細(xì)胞組件如磷脂、蛋白質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)酶和核酸等破壞，使創(chuàng)面周?chē)＜?xì)胞發(fā)生壞死及凋亡[10]。蛋白酶降解參與傷口愈合級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)及生長(zhǎng)因子，對(duì)鄰近的健康組織造成傷害，從而抑制創(chuàng)面愈合。

2.2實(shí)質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞是創(chuàng)面愈合的主要細(xì)胞，但在慢性創(chuàng)面中細(xì)菌生物膜致角質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞失活，并加速其凋亡。Secor等[11]在金黃色葡萄球菌生物膜及其浮游狀態(tài)對(duì)人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以暴露于金黃色葡萄球浮游菌的角質(zhì)細(xì)胞為對(duì)照，暴露于生物膜的角質(zhì)細(xì)胞發(fā)生快速凋亡在4 h及24 h，并在24 h后相互黏附的細(xì)胞數(shù)目顯著下降；在4 h時(shí)暴露于生物膜基質(zhì)的角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，但在24 h后，除腫瘤壞死因子α(TNF-α)外，其角質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子顯著減少，這可能與生物膜抑制角質(zhì)細(xì)胞活性并加速其凋亡有關(guān)。Kirker等[12]在研究耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的浮游菌和生物膜對(duì)人類(lèi)成纖維細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：在48 h后，成纖維細(xì)胞的細(xì)胞活性明顯降低，且黏附于培養(yǎng)皿的細(xì)胞數(shù)目顯著減少。

2.3炎癥因子及細(xì)胞因子細(xì)菌生物膜存在的慢性創(chuàng)面有異常的炎癥因子、生長(zhǎng)因子的表達(dá)，可能延遲創(chuàng)面的愈合。Kirker等[12]檢測(cè)MRSA的浮游菌和生物膜對(duì)人類(lèi)成纖維細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響發(fā)現(xiàn)，生物膜組IL-6、IL-8水平顯著減少，但生物膜組的細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α水平明顯增加。IL-6可刺激成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)生，同時(shí)增加中性粒細(xì)胞黏附于成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合；IL-8作為一個(gè)強(qiáng)有力的血管生成因子，在促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的遷移和血管再生方面發(fā)揮著重要作用，TNF-α能夠誘導(dǎo)許多細(xì)胞凋亡，可能加速創(chuàng)面愈合的實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡，而延遲創(chuàng)面愈合。Guggenheim等[13]在體外生物膜實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子被生物膜降解，通過(guò)對(duì)生物膜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，生物膜中的蛋白酶可能與細(xì)胞因子的降解有關(guān)。Kirker等[12]檢測(cè)了人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞代表性生長(zhǎng)因子[血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)]和肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)，暴露于生物膜的細(xì)胞產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子(VEGF、TGF-β1和HB-EGF)水平明顯降低，生長(zhǎng)因子將促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，這表明促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生長(zhǎng)因子減少，可能與生物膜存在的慢性創(chuàng)面難以愈合有關(guān)。

2.4創(chuàng)面pH值細(xì)胞內(nèi)外的pH值是創(chuàng)面愈合另一重要因素，且不同的治療階段需要不同pH值范圍。創(chuàng)面愈合依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)外pH值,其變化將影響血管生成、膠原蛋白的形成、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能、抗菌藥物活性。正常皮膚的pH值范圍在4.0～6.0，皮膚表面有酸性外膜，這對(duì)皮膚功能和抑制微生物致病是至關(guān)重要的，低的pH(pH=5.0)抑制微生物生長(zhǎng)[14]，已被證實(shí)正常創(chuàng)面的愈合發(fā)生在低pH值環(huán)境下，而慢性創(chuàng)面通常被檢測(cè)為堿性環(huán)境。酸化的創(chuàng)面床已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有助于創(chuàng)面感染的控制,而堿性環(huán)境則減慢創(chuàng)面愈合的進(jìn)程。有研究表明慢性創(chuàng)面pH值范圍從6.5～8.5(平均在7.4)[15]，增加pH值將增加的生物膜的產(chǎn)生[16]，堿性化的環(huán)境可能是由壞死組織、細(xì)菌及其產(chǎn)物氨造成,堿性環(huán)境的形成將進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)菌增殖。生物膜存在的慢性創(chuàng)面，有持續(xù)的炎性反應(yīng)，致中性粒細(xì)胞在創(chuàng)面聚集，中性粒細(xì)胞釋放過(guò)多彈性蛋白酶及金屬蛋白酶，堿性環(huán)境增加基質(zhì)金屬蛋白酶和中性粒細(xì)胞的彈性蛋白酶活性，增加正常組織和細(xì)胞因子的破壞，從而損傷創(chuàng)面的愈合；酸性的環(huán)境抑制中性粒細(xì)胞過(guò)度釋放蛋白酶和其破壞性的影響，將有利于慢性創(chuàng)面。大多數(shù)抗菌劑表現(xiàn)為pH依賴(lài)的抗菌活性，聚維酮碘在低pH時(shí)抗菌活性增強(qiáng)，而在高pH時(shí)抗菌活性明顯減弱[14]。直接或間接降低創(chuàng)面pH值的敷料有助于防止感染和可能更利于快速愈合。pH值降低,標(biāo)準(zhǔn)氧合血紅蛋白解離曲線向右移動(dòng)，氧合血紅蛋白釋放更多的氧氣，從而改善創(chuàng)面愈合[17]。

3　生物膜的臨床治療措施

3.1清創(chuàng)術(shù)在慢性創(chuàng)面中，創(chuàng)面清創(chuàng)術(shù)主要是清除創(chuàng)面分泌物、壞死組織、生物膜，減少細(xì)菌在創(chuàng)面的負(fù)荷量，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞趨化到創(chuàng)面,從而有利于清除殘留于創(chuàng)面的細(xì)菌[18]。清創(chuàng)術(shù)是去除和破壞生物膜最有效的方式[19]；但在清創(chuàng)后菌落計(jì)數(shù)分析揭示細(xì)菌負(fù)荷量的降低是短時(shí)間的，在清創(chuàng)后48 h內(nèi)，細(xì)菌負(fù)荷量幾乎恢復(fù)到初始水平,表明清創(chuàng)術(shù)只能短暫消除生物膜感染，如何防止清創(chuàng)后生物膜的再形成，需要其他治療的協(xié)助；在清除創(chuàng)面床深部的細(xì)菌生物膜時(shí)，要警惕清創(chuàng)術(shù)可能導(dǎo)致深層組織的感染[20]。

3.2抗菌藥物慢性創(chuàng)面中細(xì)菌生物膜難以清除的另一個(gè)原因是細(xì)菌生物膜對(duì)全身和局部抗菌藥物的耐藥。有研究表明，生物膜細(xì)菌耐受抗菌藥物濃度比其浮游狀態(tài)下高10～1 000倍[6,21]。生物膜的生長(zhǎng)分黏附期、種植期、生長(zhǎng)期、成熟期、播散期。在黏附期及播散期的浮游細(xì)菌，對(duì)各種抗菌藥物相對(duì)比較敏感，及時(shí)應(yīng)用敏感、足量抗菌藥物可阻止或破壞生物膜的形成。Wolcott等[22]在研究新形成的細(xì)菌生物膜對(duì)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在抗菌藥物治療的第一個(gè)24 h內(nèi)生物膜對(duì)其敏感，48 h后生物膜變得越來(lái)越耐受，可能是早期生物膜未發(fā)育成熟，其致密的結(jié)構(gòu)未完全形成，抗菌藥物能有效的滲透到生物膜的內(nèi)部發(fā)揮殺菌作用，隨著時(shí)間推移，生物膜發(fā)育成熟，由于滲透限制，導(dǎo)致抗菌藥物在生物膜內(nèi)達(dá)不到有效殺菌濃度。播散期及清創(chuàng)后生物膜釋放出來(lái)的浮游細(xì)菌，常常是造成臨床上常見(jiàn)的慢性感染急性發(fā)作及形成新的生物膜的重要原因，全身及局部使用抗菌藥物能夠抑制或殺滅生物膜釋放出的浮游細(xì)菌，從而控制慢性感染急性發(fā)作及新生物膜的形成。

3.3銀離子含銀離子抗菌劑是目前臨床治療慢性創(chuàng)面生物膜較為常用的敷料，其療效得到肯定。Valente等[18]在體外創(chuàng)面模型中，單獨(dú)使用銀離子敷料治療3 d，銀離子敷料覆蓋的金黃色葡萄球菌生物膜的細(xì)菌數(shù)量被降低超過(guò)100 000倍；使用銀離子敷料5 d減少了生物膜大多數(shù)細(xì)菌數(shù)量，表明銀離子敷料可抑制細(xì)菌生物膜的發(fā)展，認(rèn)為活性銀離子能夠?qū)?xì)菌的細(xì)胞壁的許多結(jié)構(gòu)組件和生化途徑產(chǎn)生毒性作用。Percival等[23]調(diào)查含銀離子創(chuàng)面敷料在銅綠假單胞菌、腸桿菌屬及金黃色葡萄球菌生物膜的療效時(shí)，發(fā)現(xiàn)生物膜暴露于銀離子敷料48 h后,生物膜內(nèi)的細(xì)菌被全部殺死。Bjarnsholt等[24]研究銀離子對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的療效時(shí)，發(fā)現(xiàn)5～10 mg/mL濃度磺胺嘧啶銀鹽能根除生物膜,但1 mg/mL的濃度沒(méi)有殺滅的效果。

3.4負(fù)壓封閉引流治療負(fù)壓封閉引流治療在治療慢性難愈合創(chuàng)面的作用逐漸得到共識(shí)，其主要機(jī)制是保持創(chuàng)面生理濕潤(rùn)的愈合環(huán)境，減少細(xì)菌負(fù)荷，增加局部血流量和促進(jìn)肉芽組織的形成。Valente等[18]在慢性創(chuàng)面的體外實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合局部銀離子敷料和負(fù)壓封閉引流治療對(duì)生物膜的影響研究中發(fā)現(xiàn)，負(fù)壓封閉引流治療引起生物膜結(jié)構(gòu)性變化,生物膜中結(jié)構(gòu)性改變涉及到其對(duì)銀離子敏感性增加,同時(shí)應(yīng)用銀離子敷料和負(fù)壓封閉引流治療生物膜的感染，生物膜中細(xì)菌數(shù)量顯著降低，銀離子敷料和負(fù)壓封閉引流治療聯(lián)合治療生物膜比單獨(dú)使用銀離子敷料抑制至少?gòu)?qiáng)10倍，證實(shí)負(fù)壓封閉引流治療與銀離子對(duì)治療生物膜有協(xié)同效果。

4　展　　望

隨著肥胖、慢性疾病、老齡人口的增加，慢性創(chuàng)面在臨床中患病率將越來(lái)越高。細(xì)菌生物膜對(duì)慢性創(chuàng)面炎癥細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、炎癥因子、細(xì)胞因子及pH值造成不利影響，使創(chuàng)面出現(xiàn)持續(xù)低效應(yīng)炎性反應(yīng)，且停滯在炎性反應(yīng)期，未能成功地進(jìn)入增生性階段及再上皮化或重塑階段，從而導(dǎo)致創(chuàng)面延遲愈合。細(xì)菌生物膜作為慢性創(chuàng)面難以愈合的主要障礙之一，積極阻止生物膜的形成將有助于控制創(chuàng)面慢性化，有效清除生物膜將是未來(lái)治療慢性創(chuàng)面研究的熱點(diǎn)，如何阻斷生物膜引起慢性創(chuàng)面持續(xù)低效應(yīng)的炎性反應(yīng)，將可能有助于創(chuàng)面的愈合。

[1]付小兵．慢性傷口診療指導(dǎo)意見(jiàn)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：11-14．

[2]劉暉，佘文莉，黃海玲，等．165例慢性創(chuàng)面住院患者臨床特點(diǎn)調(diào)查及分析[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(9)：1183-1185．

[3]Gurjala AN,Geringer MR,Seth AK,et al.Development of a novel,highly quantitative in vivo model for the study of biofilm-impaired cutaneous wound healing[J].Wound Repair Regen,2011,19(3):400-410.

[4]Bjarnsholt T.The role of bacterial biofilms in chronic infections[J].APMIS Suppl,2013,121(136):1-51.

[5]James GA,Swogger E,Wolcott R,et al.Biofilms in chronic wounds[J].Wound Repair Rege，2008(16):37-44.

[6]萬(wàn)學(xué)紅，盧雪峰．診斷學(xué)[M]．8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013:1-16．

[7]Hurlow J,Bowler PG.Potential implications of biofilm in chronic wounds:a case series[J].J Wound Care,2012,21(3):109-110.

[8]Wolcott RD,Cox S.More effective cell-based therapy through biofilm suppression[J].J Wound Care,2013,22(1):26-31.

[9]Fazli M,Bjarnsholt T,Kirketerp-M?ller K,et al.Quantitative analysis of the cellular inflammatory response against biofilm bacteria in chronic wounds[J].Wound Repair Regen,2011,19(3):387-391.

[10]Percival SL,Suleman L,Francolini I,et al.The effectiveness of photodynamic therapy on planktonic cells and biofilms and its role in wound healing[J].Future Microbiol,2014,9(9):1083-1094.

[11]Secor PR,James GA,Fleckman P,et al.Staphylococcus aureus biofilm and planktonic cultures differentially impact gene expression,mapk phosphorylation,and cytokine production in human keratinocytes[J].BMC Microbiol,2011,11(29):143.

[12]Kirker KR,James GA,Fleckman P,et al.Differential effects of planktonic and biofilm MRSA on human fibroblasts[J].Wound Repair Regen,2012,20(2):253-261.

[13]Guggenheim B,Gmür R,Galicia JC,et al.In vitro modeling of host-parasite interactions:the subgingival biofilm challenge of primary human epithelial cells[J].BMC Microbiol,2009,9(11):280.

[14]Wiegand C,Abel M,Ruth P,et al.pH influence on antibacterial efficacy of common antiseptic substances[J].Skin Pharmacol Physiol,2015,28(3):147-158.

[15]in Europe T:Experience Eberlein.12th congress of the German society of woundhealing,freiburg[Z].2010.

[16]Hostacká A,Ciznár I,Stefkovicová M.Temperature and pH affect the production of bacterial biofilm[J].Folia Microbiol (Praha),2010,55(1):75-78.

[17]Percival SL,Mccarty S,Hunt JA,et al.The effects of pH on wound healing,biofilms,and antimicrobial efficacy[J].Wound Repair Regen,2014,22(2):174-186.

[18]Valente PM,Deva A,Ngo Q,et al.The increased killing of biofilms in vitro by combining topical Silver dressings with topical negative pressure in chronic wounds[J].Int Wound J,2016,13(1):130-136.

[19]Percival SL,Hill KE,Williams DW，et al.A review of the scientific evidence for biofilms in wounds[J].Wound Rep Reg,2012,20(5):647-657.

[20]Roy S,Elgharably H,Sinha M,et al.Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function[J].J Pathol,2014,233(4):331-343.

[21]謝軼,賈文祥.生物膜與細(xì)菌耐藥性[C]//周學(xué)東,施文元.微生物生物膜與感染[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:127-133．

[22]Wolcott RD,Rumbaugh KP,James G,et al.Biofilm maturity Biofilms in wounds Percival et al.studies indicate sharp debridement opens a time-dependent therapeutic window[J].J Wound Care，2010,19(8):320-328.

[23]Percival SL,Bowler P,Woods EJ.Assessing the effect of an antimicrobial wound dressing on biofilms[J].Wound Repair Regen,2008,16(1):52-57.

[24]Bjarnsholt T,Kirketerp-M ?ller K,Kristiansen S,et al.Silver against Pseudomonas aeruginosa biofilms[J].APMIS,2007,115(8):921-928.

牟天易(1987-)，在讀碩士，主要從事慢性創(chuàng)面研究?！?/p>

，E-mail:hgjian@sohu.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.043

R641

A

1671-8348(2016)07-0988-03

2015-09-02

2015-11-15)